藥用植物細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌的分離和分子鑒定

詹昕燁

(臺州市第一中學(xué)，浙江 臺州 318000)

蘭科(Orchidaceae)是高等植物的第二大科，在全球各地均有分布，約有700屬20 000余種，其中蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)、鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)、大花無柱蘭(Amitostigmapinguiculum)、長瓣兜蘭(Paphiopedilumdianthum)和細(xì)葉石仙桃(Pholidotacantonensis)等多個物種是著名的藥用植物和觀賞性珍貴花卉[1]。細(xì)葉石仙桃隸屬蘭科石仙桃屬(Pholidota)，又名小石仙桃、果上葉和巖豆等。全草均可入藥，具有清熱涼血、滋陰潤肺和消腫止痛等功效[2-3]。內(nèi)生菌一詞最早由De Bary[4]提出，指生活在健康植物組織內(nèi)的微生物，包含內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和放線菌等。100多年前，人們首次發(fā)現(xiàn)了植物內(nèi)生菌的存在[5]。內(nèi)生菌具有十分豐富的生物多樣性，一種植物體內(nèi)通?？煞蛛x得到數(shù)十種甚至數(shù)百種內(nèi)生菌[6]。Arnold等[7]對巴拿馬中部雨林2種植物葉片的內(nèi)生菌進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離自83個健康葉片的內(nèi)生菌多達(dá)972個形態(tài)學(xué)種。

植物內(nèi)生細(xì)菌是一類在植物組織內(nèi)部生存，對宿主沒有傷害的微生物，對植物的生長發(fā)育有一定促進(jìn)作用，尤其對種子萌發(fā)、增強植株抗逆性有較好的生物學(xué)功能，在蘭科植物生活史中具有不可忽視的作用[8-9]。細(xì)菌進(jìn)入植株體內(nèi)的方式有很多，其中，植物的氣孔、皮孔和傷口等處都是入宿的通道[10-11]。經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，感染內(nèi)生細(xì)菌的植物往往比未感染的植株具有更強的適應(yīng)性，對環(huán)境脅迫的抗逆性強、他感作用強，且生長速度快，產(chǎn)量高。陳麗梅等[12]對甘蔗(Subtrib saccharinae)體內(nèi)的重氮營養(yǎng)醋桿菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)甘蔗吸收的氮素80%可能來自生物固氮，只有少數(shù)來自人工施加的化學(xué)氮肥。潘麗晶等[13]對蝴蝶蘭(Phalaenopsisaphrodite)根部內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭根內(nèi)生長著可分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)的內(nèi)生細(xì)菌。這些實驗也證明了植物內(nèi)生細(xì)菌具有增強對必需元素的吸收和產(chǎn)生植物促生物質(zhì)等功能，解釋了植物生長速度加快的原因。近年來，對植物內(nèi)生細(xì)菌的研究報道較多，但有關(guān)細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌的研究尚未見報道。本實驗以細(xì)葉石仙桃為研究對象，在分離內(nèi)生細(xì)菌的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)葉石仙桃樣品采自樂清雁蕩山、臨海白巖山和黃巖劃巖山，剪取假鱗莖帶回實驗室，用大量自來水沖洗后備用。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌分離與培養(yǎng)

內(nèi)生細(xì)菌分離采用組織塊分離法：在超凈工作臺上，先用大量的無菌水沖洗，再用75%乙醇擦拭，用無菌濾紙吸干表面殘留的液體；用無菌刀片將假鱗莖切成小塊，置于無菌研缽中，加入5 mL無菌水充分研磨，取500 μL研磨液于10 mL無菌離心管中，加入無菌水稀釋至3 mL，搖勻后備用。

內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)：用微量移液器吸取8 μL稀釋液，均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上；將培養(yǎng)皿進(jìn)行封口并做好標(biāo)記；28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每隔12 h觀察1次并拍照記錄細(xì)菌生長情況。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增

挑取內(nèi)生細(xì)菌的單菌株，接種到LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫?fù)u床中200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h后用作PCR模板。PCR引物采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[14]。反應(yīng)體系為：10 × PCR Buffer 2.0 μL，dNTPs 0.5 μL，27F和1492R引物各0.4 μL，菌液模板0.5 μL和TaqDNA聚合酶0.4 μL，最后加入適量ddH2O至總體積20 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共循環(huán)32次；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。選取條帶亮度高且清晰的產(chǎn)物測序，引物合成與序列測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2.3 革蘭氏陰、陽性鑒定

以安徽省巢湖市弘慈醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的革蘭氏染色液為鑒定試劑，對內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏陰陽性鑒定[15-16]。具體步驟為：取潔凈載玻片數(shù)張，平放桌上，取一環(huán)需要鑒定的菌液涂布成1個直徑1.0～1.5 cm的圓形涂片，自然干燥；將Ⅰ液滴加在細(xì)菌涂片上，染色1 min后用蒸餾水洗去多余染料；滴加Ⅱ液，1 min后用蒸餾水洗去多余染料；滴加Ⅲ液脫色30 s，水洗；滴加Ⅳ液復(fù)染1 min，用蒸餾水洗去多余染料，自然干燥后鏡檢。若細(xì)菌呈藍(lán)紫色則為革蘭氏陽性菌，呈紅色則為陰性細(xì)菌[17]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA測序結(jié)果，與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行相似性比對分析，確定菌株的種屬[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離培養(yǎng)

將內(nèi)生細(xì)菌菌液均勻涂布到LB固體培養(yǎng)基，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h觀察1次細(xì)菌的生長情況。結(jié)果顯示，LB固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)的單菌落顏色、大小和生長速率均有差異；菌落光滑、凸起，且生長速度快。由雁蕩山采集的材料內(nèi)生細(xì)菌生長迅速，菌落間存在顏色和生長速度的差異(圖1)。白巖山和劃巖山細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌觀察到類似的現(xiàn)象，也發(fā)現(xiàn)了大小不一的金黃色、淡黃色和白色的菌落。

A為0 h；B為24 h；C為48 h圖1 雁蕩山細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌的生長動態(tài)

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的革蘭氏染色

采用革蘭氏染色法對細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行鑒定，染色結(jié)果表明：所有供試材料分離得到的73個內(nèi)生細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果均呈現(xiàn)紅色，表明從細(xì)葉石仙桃假鱗莖中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌都是革蘭氏陰性菌。同時在油鏡下對細(xì)菌形態(tài)特征進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)雁蕩山1～20號內(nèi)生細(xì)菌均呈長桿狀，初步鑒定1～20號菌為桿菌。經(jīng)鏡檢，白巖山和劃巖山細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌也均為桿菌。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列的克隆

以內(nèi)生細(xì)菌菌液為DNA模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，所有內(nèi)生細(xì)菌樣品均可擴(kuò)增出大小約為1 500 bp的PCR產(chǎn)物(圖2)。電泳條帶單一、清晰且亮度大，可用于后續(xù)的測序?qū)嶒灐?/p>

M為100 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～10為內(nèi)生細(xì)菌的PCR產(chǎn)物圖2 雁蕩山細(xì)葉石仙桃部分內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 內(nèi)生細(xì)菌的序列分析

根據(jù)測序結(jié)果，利用Blast在線工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對來自雁蕩山、白巖山和劃巖山73個內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對，以序列匹配度98%為最低指標(biāo)確定種屬。結(jié)果表明：雁蕩山和白巖山細(xì)葉石仙桃中均分離得到9種內(nèi)生細(xì)菌，劃巖山的樣品分離得到11種內(nèi)生細(xì)菌。73個單菌株隸屬9個屬，分別為果膠桿菌屬(Pectobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、科澤氏菌屬(Koserella)、藤黃色桿菌屬(Koserella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)(表1)。芽孢桿菌屬的種類最多，有3種，分別為巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌；類芽孢桿菌屬和假單胞菌屬次之，各為2種，分別是膠質(zhì)類芽孢桿菌與多粘類芽孢桿菌、斯氏假單胞菌與棲稻假單胞菌。杓蘭果膠桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、雷金斯堡預(yù)研菌、藤黃色桿菌、腸桿菌和斯氏假單胞菌在3個樣地采集到的細(xì)葉石仙桃內(nèi)均有分布。

表1 不同地理來源的細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌的 種類分布

注：+ 表示有，-表示無。

3 討論

目前，在各種植物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已超過54個屬120多種[19]。朱育菁等[20]在無患子科(Sapindaceae)龍眼(Dimocarpuslongan)果實內(nèi)分離到腸桿菌屬、果膠桿菌屬、克魯沃菌屬(Kluyvera)和沙門氏桿菌屬(Salmonella)等內(nèi)生菌。內(nèi)生細(xì)菌中，大多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌為土壤微生物種類，其中假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬以及土壤桿菌屬(Agrobacterium)最為常見[19]。本實驗從細(xì)葉石仙桃體內(nèi)分離得到假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、果膠桿菌屬、產(chǎn)酸克雷伯菌和成團(tuán)泛菌等多種細(xì)菌種屬。假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬還有伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)等是多種林木植物的解磷細(xì)菌[21-23]。杓蘭果膠桿菌也是一種解磷細(xì)菌，可通過自身的代謝活動將土壤基質(zhì)中難溶的磷元素轉(zhuǎn)化為可溶性磷，利于植物吸收從而提高產(chǎn)量[24]。王舒等[25]從油茶(Camelliaoleifera)中分離到杓蘭果膠桿菌等3種細(xì)菌，對其解磷能力進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示，篩選得到菌株的解磷能力都較高，可有效提高油茶對磷的利用率。

生物固氮可為農(nóng)業(yè)提供經(jīng)濟(jì)價值高、對環(huán)境無污染的氮肥，是生物學(xué)領(lǐng)域的一項重要研究課題[26]?？死撞暇鷮偈且活惞痰?，呈革蘭氏陰性[27]，本實驗結(jié)果與此一致。李宏偉等[28]和朱俊波[29]對克雷伯氏菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其SW1菌株具有較高的固氮酶活性，HP1菌株具有較高產(chǎn)氫活力，通常用于制備氫燃料。陳卓君等[30]以白菜(Brassicapekinensis)、油菜(B.campestris)和玉米(Zeamays)作為研究材料，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸克雷伯菌可通過固氮和產(chǎn)生生長素促進(jìn)植物生長。馮永君[31]初步發(fā)現(xiàn)成團(tuán)泛菌YS19可利用光合作用固定的有機(jī)碳源和能量進(jìn)行代謝來固定大氣中的游離氮氣，促使植物更好生長。本研究中，在3個樣點的細(xì)葉石仙桃中均分離到產(chǎn)酸克雷伯氏菌，它是否具有固氮作用，尚待進(jìn)一步研究。

假單孢菌屬細(xì)菌在植物病害的生物防治上有著廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌能在代謝反應(yīng)中產(chǎn)生多種抗菌產(chǎn)物，可有效抵御病原細(xì)菌、真菌和線蟲等微生物，部分產(chǎn)物還具殺蟲功能，可替代農(nóng)藥試劑，提升植物的抗病能力，在保護(hù)生態(tài)環(huán)境方面也有潛在價值[32-34]。朱玥妍等[35]對芽孢桿菌屬的多種菌進(jìn)行研究分析，提出芽孢桿菌可作為生防菌劑，其中，地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis)對番茄(Lycopersiconesculentum)、棉花(Ginkgobiloba)和辣椒(Capsicumannuum)等多種植物的病害有防治功能，如番茄灰霉病和棉花枯萎病等[36-37]。韋氏芽孢桿菌在生物防治方面也有較好的前景，對馬鈴薯(Solanumtuberosum)壞疽病、枯萎病和炭疽病等也均具防治效果，而且還有溶磷和固氮作用[38]。張淑梅等[39]從番茄葉片中分離篩選到具廣譜抑真菌活性的類芽孢桿菌，其對水稻(Oryzasativa)惡苗病菌有明顯的拮抗抑制作用。本研究中，分離到膠質(zhì)類芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌等芽孢桿菌，膠質(zhì)類芽孢桿菌為雁蕩山細(xì)葉石仙桃所特有，韋氏芽孢桿菌為劃巖山樣品所特有，今后將進(jìn)一步研究它們的功能。

研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌易在細(xì)胞或組織的間隙形成聚集群落，便于吸收營養(yǎng)物質(zhì)，也避免環(huán)境威脅，保證了生存環(huán)境的適宜性[10]。內(nèi)生細(xì)菌可作為聯(lián)合固氮菌劑，對植物固氮起到積極作用，可分泌產(chǎn)生多種對植物有促生作用的激素，也可用作載體將外源基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞[40-41]。許多內(nèi)生細(xì)菌在非豆科植物固氮方面的作用十分顯著，在溶磷和抗蟲抗病等方面也有較大作用，在環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中更是具有潛在的應(yīng)用價值[42-43]。本實驗對細(xì)葉石仙桃內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離與鑒定，得到果膠桿菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬和芽孢桿菌屬等多種屬種，為進(jìn)一步研究生物固氮、防治以及溶磷作用提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論支持，為進(jìn)一步探索內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)功能和生理提供一定的基礎(chǔ)材料。

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