浙江寒蘭花粉萌發(fā)及貯藏特性

王曉樂，楊艷萍，付雙彬，姚麗娟，曾愛平，應(yīng) 震，周 莊

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

寒蘭(CymbidiumkanranMakino)，蘭屬地生植物，株型修長健美，葉姿優(yōu)雅俊秀，花色艷麗多變，香味清醇久遠(yuǎn)，為國蘭之一，在我國具有悠久的栽培歷史。寒蘭大多于10月至翌年2月開花，花期較長，且早于大多數(shù)春天開花的蘭科植物，導(dǎo)致不同種質(zhì)資源(包括同屬和不同屬蘭科植物)因花期不遇、地理隔離無法進(jìn)行雜交，嚴(yán)重制約寒蘭育種研究的發(fā)展。

花粉生活力測定與儲藏性的研究是解決雜交親本在空間與時間上的隔離進(jìn)而擴(kuò)大育種范圍的前提，但目前未見針對寒蘭花粉生活力檢測及貯藏性的相關(guān)研究報道。早期花粉生活力的研究主要集中在萌發(fā)培養(yǎng)基的成分篩選上，尤其是蔗糖濃度的選擇。Pritchard等[1]在1910年以2種歐洲蘭花為材料，篩選出最適宜萌發(fā)的培養(yǎng)基蔗糖濃度為5%～10%；除此之外，以其他11種蘭花花粉為材料，對其花粉萌發(fā)影響因素和貯藏特性進(jìn)行了研究。邵青松等[2]研究金線蓮花粉的萌發(fā)結(jié)果顯示，花粉活力表現(xiàn)出先升后降的趨勢，開花第3天的花粉活力最強(qiáng)，適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢匝娱L花粉生活力。鄧茜玫等[3]對聚石斛花粉生活力進(jìn)行研究，篩選出了最適宜的花粉萌發(fā)培養(yǎng)基，開花8 d之前的花粉生活力均高于65%，作為父本授粉結(jié)實(shí)率高于85%；-20 ℃貯存90 d后花粉萌發(fā)率降為21.7%，雜交授粉后仍然能夠正常結(jié)實(shí)。

本研究采用固體培養(yǎng)基，研究了蔗糖、氯化鈣、硼酸對寒蘭花粉萌發(fā)的影響，對比了不同干燥時間、貯藏溫度、貯藏時間對花粉生活力的影響，以期篩選出寒蘭花粉離體萌發(fā)最佳培養(yǎng)基和適宜的花粉貯藏方法，為有效開展寒蘭雜交育種提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2016年11月至2017年4月進(jìn)行，材料為浙江省亞熱帶作物研究所大棚生長的浙江寒蘭(簡稱寒蘭)。

1.2 處理設(shè)計

1.2.1 花粉萌發(fā)培養(yǎng)基篩選

采用3因素4水平正交試驗(yàn)：蔗糖濃度設(shè)1%、5%、10%、15% 4個濃度梯度，單位為g·100 mL-1；氯化鈣設(shè)10、50、100、150 mg·L-14個濃度梯度；硼酸設(shè)10、50、100、150 mg·L-14個濃度梯度。所有母液用針頭濾器(Millipore，0.22 μm)滅菌，所有用水為無菌水。配置好所有正交試驗(yàn)組合之后，加瓊脂至濃度為0.3%(單位為g·100 mL-1)，完全溶解后加2.5 mL固體培養(yǎng)基到40 mm一次性培養(yǎng)皿中鋪板。取開花后3～5 d的花粉塊于適量無菌水中吸脹30 min，用移液槍打散花粉團(tuán)，每個培養(yǎng)皿點(diǎn)6個花粉斑，每個斑點(diǎn)3 μL。培養(yǎng)皿置于25 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)36 h，于生物顯微鏡(Olympus，BX53)下鏡檢，每個試驗(yàn)組觀測最少5個視野，每個視野最少觀察50個花粉粒，并統(tǒng)計萌發(fā)率?；ǚ勖劝l(fā)以花粉管長度大于花粉粒2倍直徑為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 干燥時間對花粉萌發(fā)的影響

收集開花后3～5 d的花粉分裝入3個10 mL圓底管中，置于干燥器中室溫干燥1、2、3 d，以不干燥花粉作為對照。將4組花粉于-20 ℃貯存15 d，后轉(zhuǎn)移至4 ℃放置2 h，30～35 ℃水浴鍋復(fù)水30 min，進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗(yàn)。顯微鏡觀察并統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.3 低溫貯存對花粉萌發(fā)的影響

收集開花后3～5 d的花粉，干燥1 d，分別置于4、-20、-80 ℃進(jìn)行保存，于15、30、90 d檢測不同貯存溫度下花粉萌發(fā)率。-20、-80 ℃取出的花粉需梯度恢復(fù)至室溫再進(jìn)行復(fù)水。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對寒蘭花粉萌發(fā)的影響

氯化鈣濃度對花粉萌發(fā)具有較大的影響(表1)。當(dāng)氯化鈣濃度為10、50 mg·L-1時，平均萌發(fā)率分別為79%和78%，濃度為100、150 mg·L-1時，平均萌發(fā)率則分別下降到69%和64%。蔗糖對寒蘭花粉萌發(fā)影響僅次于氯化鈣，最適宜濃度為1%，但與5%、10%濃度下的平均萌發(fā)率差異并不顯著；當(dāng)蔗糖濃度為15%時，其平均萌發(fā)率顯著降低。硼酸對寒蘭花粉萌發(fā)的貢獻(xiàn)率相對最小，最適濃度為50 mg·L-1。由此正交試驗(yàn)得出的寒蘭花粉萌發(fā)最優(yōu)培養(yǎng)基組合為蔗糖1%，硼酸50 mg·L-1，氯化鈣10 mg·L-1。

2.2 干燥時間對寒蘭花粉萌發(fā)的影響

花粉含水量是影響花粉低溫保存質(zhì)量的重要因素，含水量越高，冷凍時越容易形成冰晶，細(xì)胞膜受損越嚴(yán)重，花粉死亡率就越高。結(jié)果顯示：未經(jīng)干燥處理的花粉萌發(fā)率為69%；干燥1 d的花粉在-20 ℃保存15 d，其萌發(fā)率最高可達(dá)79%；干燥2、3 d的花粉萌發(fā)率大幅降低，分別為38%和29%。

2.3 低溫貯存對花粉萌發(fā)的影響

花粉的低溫保存(4～-20 ℃)是一種操作簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的花粉保存方法[4]，能延長花粉的

表1 不同培養(yǎng)基中寒蘭花粉的萌發(fā)率

壽命，解決植物雜交育種中花期不遇及異地雜交的難題。本研究結(jié)果(表2)表明，3種不同溫度下低溫保存30 d，花粉萌發(fā)率均可達(dá)50%以上；其中，-80 ℃保存30 d的花粉萌發(fā)率最高，為66%，基本滿足授粉結(jié)實(shí)的要求。低溫保存90 d，-80 ℃保存的花粉萌發(fā)率急劇下降到40%，-20 ℃保存的花粉萌發(fā)率相對最高，為48%，4 ℃保存的花粉萌發(fā)率最低，僅為31%。

表2 低溫貯存對寒蘭花粉萌發(fā)率的影響

注: 同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

花粉是種子植物雄配子體或雄配子細(xì)胞的載體，其生活力決定了受精過程的成敗，花粉萌發(fā)率則是衡量其生活力的重要指標(biāo)。本研究通過正交試驗(yàn)篩選出寒蘭花粉萌發(fā)的最優(yōu)培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步研究了干燥、低溫對花粉貯藏性的影響。

蔗糖是大多數(shù)植物花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基必不可少的成分，不僅可以平衡培養(yǎng)基與花粉內(nèi)外滲透壓，還可為花粉管的生長提供碳源[5]，其最優(yōu)濃度隨物種的變化差異較大。除本研究中所用寒蘭之外，香莢蘭所需最佳蔗糖濃度也為5%[6]，聚石斛[3]、墨蘭[7]、卡特蘭[8]和白芨[9]的花粉萌發(fā)所需最佳蔗糖濃度均為10%；個別蘭科植物花粉萌發(fā)需高濃度蔗糖，如無距蝦脊蘭[10]和大花蕙蘭[11]，分別為20%和30%。除了濃度差別，碳源種類也會影響花粉萌發(fā)。楊文波等[6]研究表明，離體培養(yǎng)莢蘭花粉萌發(fā)時，以5%的乳糖為碳源萌發(fā)率最高，其次是5%蔗糖，果糖效果最差。

花粉的離體萌發(fā)和花粉管生長都需要從培養(yǎng)基中吸收大量鈣離子，降低培養(yǎng)基中的鈣離子濃度能夠明顯抑制花粉萌發(fā)，因此，適宜的鈣離子濃度是花粉體外萌發(fā)所必需的[12]。外源鈣可以替代花粉萌發(fā)時的群體效應(yīng)[13]。本試驗(yàn)中，鈣離子濃度對寒蘭花粉離體萌發(fā)影響顯著，最適宜濃度為10 mg·L-1，高濃度鈣離子會抑制花粉管萌發(fā)，與之相似的是墨蘭，最適鈣離子濃度僅為5 mg·L-1[7]。但在卡特蘭離體萌發(fā)培養(yǎng)基中，鈣離子可高達(dá)150 mg·L-1，但是只起輔助作用[8]，這可能是由于寒蘭和卡特蘭親緣關(guān)系較遠(yuǎn)而造成的。

花粉貯存是解決花期不遇、地理隔離型生殖隔離的有效手段。本研究中，4 ℃貯存的寒蘭花粉在所檢測的時間點(diǎn)萌發(fā)率均最低；保存30 d，-80 ℃貯存的花粉萌發(fā)率最高；保存90 d，-20 ℃貯存的花粉萌發(fā)率最高。因此，若需長期保存花粉，推薦采用-20 ℃。部分超低溫保存的植物花粉萌發(fā)率可以基本不變，甚至個別物種在保存過程中萌發(fā)率還出現(xiàn)上升的情況[14-15]。但本研究中，-80 ℃保存的寒蘭花粉萌發(fā)率下降十分嚴(yán)重，原因可能是-80 ℃對缺乏凍存保護(hù)劑的花粉造成了損傷，降低了其萌發(fā)率[16]，未進(jìn)行預(yù)冷凍和程序性降溫也可能是導(dǎo)致花粉萌發(fā)率下降的原因之一。

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