諾如病毒檢測(cè)技術(shù)研究

潘衛(wèi)兵+許韡

摘 要：諾如病毒是非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)的主要病原之一，對(duì)相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的研究十分必要。本文通過(guò)引物、探針、染料的選擇，結(jié)合適用范圍、靈敏度、特異性、重復(fù)性的評(píng)估對(duì)常規(guī)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)、熒光定量RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、基因芯片、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和熒光微球檢測(cè)條快速檢測(cè)諾如病毒的技術(shù)進(jìn)行了綜述。著重關(guān)注了食品和水中諾如病毒檢測(cè)的病毒富集技術(shù)，并提出平衡準(zhǔn)確靈敏與簡(jiǎn)便高效對(duì)諾如病毒檢測(cè)技術(shù)的研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞：諾如病毒；聚合酶鏈反應(yīng)；熒光定量；反轉(zhuǎn)錄；RT-PCR；RT-LAMP

中圖分類(lèi)號(hào)：R373.2+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.02.18

文章編號(hào)：1006-1959（2018）02-0051-03

Abstract：Norovirus is one of the main pathogens in non bacterial diarrhea，research on correlation detection technology is very necessary.This paper probes，primers，dye selection，combined with the applicable scope，sensitivity，specificity，repeatability of the evaluation of conventional reverse transcription polymerase chain reaction，fluorescence quantitative reverse transcription loop mediated RT-PCR.Mediated isothermal amplification，gene chip，ELISA and fluorescent microsphere detection strip for rapid detection of norovirus technology are reviewed.Focusing on the technology of virus detection in food and water enrichment of norovirus，and put forward the balance is accurate and sensitive and efficient research on the detection of norovirus has important significance.

Key words：Norovirus；Polymerase chain reaction；Fluorescence quantitation；Reverse transcription；RT-PCR；RT-LAMP

諾如病毒（norovirus）引起的急性腸胃炎在我國(guó)成上升趨勢(shì)，尤其在學(xué)校、幼兒園、養(yǎng)老院等低抵抗力人群聚集地易引起集體暴發(fā)。諾如病毒傳染性很強(qiáng)，可經(jīng)糞-口傳播、人傳人、可經(jīng)受病毒污染的水、食品等傳播。據(jù)估計(jì)，由諾如病毒造成的非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)占總數(shù)的50%～80%左右[1]。近年來(lái)，諾如病毒檢測(cè)方法的相關(guān)研究快速發(fā)展，對(duì)諾如病毒的準(zhǔn)確檢測(cè)為其流行病學(xué)分析提供了依據(jù)，是有效防控該病毒的基礎(chǔ)。

1 病毒分型

諾如病毒依據(jù)其基因RNA聚合酶和主要衣殼蛋白VP1的核苷酸序列的同源性，可分為5個(gè)基因組：GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ，其中易感染人的主要是GⅠ和GⅡ基因組，國(guó)內(nèi)尤以 GⅡ?yàn)槎唷６赩P1基因組序列的相似性以>85%為界，可進(jìn)一步將基因組分為不同的基因型：GⅠ-8個(gè)型，GⅡ-21個(gè)型，GⅢ-3個(gè)型，GⅣ-2個(gè)型，GⅤ-1個(gè)型[2]。

2 檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

目前諾如病毒的檢測(cè)技術(shù)主要有反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、熒光定量RT-PCR、反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）、基因芯片、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）和熒光微球檢測(cè)條快速檢測(cè)。

2.1 常規(guī)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄RT技術(shù)是將RNA為模板，以反轉(zhuǎn)錄酶催化，用引物合成互補(bǔ)DNA，再經(jīng)PCR采用特異性引物擴(kuò)增[3]，是定性檢測(cè)諾如病毒的經(jīng)典技術(shù)。

王作虪等[4]用RT-PCR對(duì)131份腹瀉兒童的糞便標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，使用兩對(duì)引物：① JV12：5'ATACCACTATGATGCAGATTA 3'/SM31：5'CGATTTCATCATCACCATA 3'，擴(kuò)增目標(biāo)長(zhǎng)度為432bp；②4581： 5'TCTTCTCCTTCTATGGTGATGATGA3'/5102：5'CTTAGACGCCATCTTCATTTACG 3'，擴(kuò)增目標(biāo)長(zhǎng)度為522bp，通過(guò)振蕩離心過(guò)濾后從糞便標(biāo)本中提取出病毒RNA，經(jīng)引物反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)特異性片段，結(jié)果131份糞便標(biāo)本中檢出諾如病毒陽(yáng)性22份，陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)和已知核苷酸序列比對(duì)鑒定出22份標(biāo)準(zhǔn)均為GⅡ4型。

2.2熒光定量RT-PCR 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)是在RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上利用染料或探針監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)管中的熒光信號(hào)從而達(dá)到定量的目的，目前實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR已逐漸替代常規(guī)RT-PCR成為應(yīng)用最為廣泛的定量定性檢測(cè)諾如病毒的技術(shù)。

陳傳德等[5]選擇了兩種不同型號(hào)的熒光定量PCR儀，分別制作絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以O(shè)G 1F/COG 1R、COG 2F/COG 2R為引物，以Taqman探針監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)，建立了有良好靈敏度、重復(fù)性的熒光定量RT-PCR快速檢測(cè)諾如病毒的技術(shù)，并通過(guò)試驗(yàn)了輪狀病毒、腺病毒、星狀病毒、腸道病毒等易引起干擾的病毒，得出該方法具有良好的特異性。劉巍等[6]比較了熒光定量RT-PCR、常規(guī)RT-PCR、酶聯(lián)免疫法ELISA，對(duì)34個(gè)糞便樣本陽(yáng)性檢出率分別為85.3%、76.5%、26.5%，可見(jiàn)熒光定量RT-PCR技術(shù)對(duì)諾如病毒的檢測(cè)靈敏度較高。王毅謙等[7]用雙重?zé)晒釸T-PCR的方法檢測(cè)GⅠ和GⅡ型諾如病毒，該研究使用allglo探針，對(duì)GⅠ和GⅡ型諾如病毒的檢出限為10copies/μl，比Taqman探針?lè)ê蛦沃責(zé)晒釸T-PCR法更加靈敏，該研究設(shè)計(jì)的引物和allglo探針，標(biāo)記不同的熒光報(bào)告集團(tuán)MAR和JUP，可于同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)GⅠ和GⅡ型諾如病毒，提高了檢測(cè)效率。莫雪梅等[8]用SYBR GreenⅠ熒光染料RT-PCR法檢測(cè)了貝類(lèi)中的GⅡ型諾如病毒，檢測(cè)下限為100copies，檢測(cè)的穩(wěn)定性較好，研究證明SYBR GreenⅠ熒光染料的濃度是影響結(jié)果的關(guān)鍵因素，濃度過(guò)低造成熒光強(qiáng)度小靈敏度不夠，濃度過(guò)高會(huì)抑制PCR反應(yīng)，SYBR GreenⅠ熒光染料的終濃度為1×是合適的，此外該研究還將退火溫度提高到52 ℃以消減引物二聚體引起的干擾，達(dá)到了良好的效果。endprint

2.3病毒的富集 在檢測(cè)食品與水中諾如病毒時(shí)，由于病毒含量小，此時(shí)病毒的富集成為了最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，如膜過(guò)濾法和有機(jī)絮凝沉淀法[9]等富集手段。在采樣后，食品樣品的處理主要有兩個(gè)步驟：先對(duì)樣本基質(zhì)上諾如病毒的洗脫和濃縮，然后提取諾如病毒的核酸，其中由以從樣本基質(zhì)上洗脫和濃縮諾如病毒最為關(guān)鍵[10]。鄧麗麗等[11]在用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)牡蠣中諾如病毒時(shí)，著重摸索前處理方法，即病毒的富集，他們通過(guò)化甘氨酸緩沖液處理牡蠣勻漿液，摸索聚乙二醇（PEG）沉淀濃縮病毒的濃度，得到甘氨酸緩沖液pH值為4.5，PEG沉淀濃度為16%時(shí)的諾如病毒富集提取效果最好。周曉紅等[12]評(píng)估了用混合硝酸纖維素膜（MCE）和PEG沉淀共二次富集的方法檢測(cè)水中諾如病毒的方法，證明該方法將水樣濃縮了1000倍，大大提高了靈敏度，可用于水體中諾如病毒的檢測(cè)。李楠等[13]比較了磁珠富集法和PEG沉淀法檢測(cè)草莓中GⅡ型諾如病毒的適用性，結(jié)果顯示磁珠富集法的回收率略高于PEG沉淀法的回收率，而且兩種方法的回收率結(jié)果均能滿足檢測(cè)要求，均適用于檢測(cè)草莓中的GⅡ型諾如病毒，該研究也給其他的食品類(lèi)樣本的病毒富集提供了一定的參考。張其剛等[14]比較豬胃黏蛋白偶聯(lián)磁珠和PEG8000富集檢測(cè)了青蔥和葡萄中的諾如病毒，結(jié)果顯示對(duì)青蔥來(lái)說(shuō)，高接種量下兩種富集方法回收率差不多，低接種量下豬胃黏蛋白偶聯(lián)磁珠法的回收率高于PEG8000，而對(duì)于葡萄來(lái)說(shuō)，豬胃黏蛋白偶聯(lián)磁珠法高低接種量的回收率均高于PEG8000，顯示PGM-MB法富集效果要好于PEG8000，這與研究[13]的結(jié)果是吻合的。徐奮奮等[15]將不同濃度的GⅡ型諾如病毒加入水中，用鈣離子法富集，研究結(jié)果顯示鈣離子富集法對(duì)水中GⅡ型諾如病毒的檢測(cè)回收率可以達(dá)到81.6%，檢測(cè)靈敏度達(dá)到10copies/μL，均較好，且具備快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，適用于基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行水中GⅡ型諾如病毒的快速檢測(cè)。

2.4反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 羅劍鳴等[16]建立了一種基于顏色判定的GⅡ型諾如病毒的RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)擴(kuò)增前加入羥基萘酚藍(lán)染料，以顏色變化判斷結(jié)果，結(jié)論顯示此方法與常規(guī)RT-PCR相比靈敏度相當(dāng)，檢測(cè)效率更高，可用于GⅡ型諾如病毒的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

2.5基因芯片 史蕾等[17]用鏈霉親和素包被的磁珠作標(biāo)記物，以生物素標(biāo)記的核算為樣本，通過(guò)它們的親和作用，進(jìn)行核算雜交檢測(cè)，建立了基于磁珠的可視化基因芯片檢測(cè)諾如病毒，結(jié)論顯示該方法靈敏度、特異性、重復(fù)性均較好，且具有快速、直觀的優(yōu)點(diǎn)。

2.6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 溫來(lái)欣等[18]建立了異硫氰算熒光素（FITC）-抗FITC放大系統(tǒng)的檢測(cè)人糞便中諾如病毒抗原的ELISA法，通過(guò)與商業(yè)化酶聯(lián)免疫法試劑盒比對(duì)，得出該方法靈敏度、特異性均較好，且具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。

3 總結(jié)

依據(jù)諾如病毒的污染途徑，糞便、食品、水成為了諾如病毒檢測(cè)的主要樣本，糞便的檢測(cè)技術(shù)的研究相對(duì)更成熟，對(duì)于食品和水來(lái)說(shuō)，怎樣合理有效的將病毒富集，避免過(guò)程的損失成為檢測(cè)靈敏度是否滿足要求的決定性環(huán)節(jié)，故食品和水中諾如病毒檢測(cè)的相關(guān)研究聚焦于病毒的富集技術(shù)是必要的。

諾如病毒的檢測(cè)技術(shù)發(fā)展至今，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)因其具備可靠的靈敏度、特異性等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成為應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)為了適應(yīng)疫情暴發(fā)的及時(shí)處置，一些更加適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的試劑條、試劑盒等技術(shù)也正在快速發(fā)展。對(duì)研究者來(lái)說(shuō)，怎樣處理好準(zhǔn)確靈敏與簡(jiǎn)便高效這二者之間的平衡對(duì)諾如病毒檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展具有重要意義。

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收稿日期：2017-7-8；修回日期：2017-8-12

編輯/成森endprint