致孔劑溶解度參數(shù)對(duì)大孔層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響研究

蘭夢(mèng)菲

摘 要 分別以甲基丙烯酸縮水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯為功能單體和交聯(lián)劑，采用懸浮聚合方法制備了大孔聚合物微球?？疾炝酥驴讋┑慕M成及用量對(duì)微球的孔徑、比表面積的影響，其中隨著致孔劑中的良溶劑（二氯甲烷 δ=9.7 （cal/cm3）1/2）和不良溶劑（正辛醇δ=10.3 （cal/cm3）1/2的比例變化，致孔劑體系溶解度參數(shù)可調(diào)范圍為9.89～10.09 （cal/cm3）1/2），隨著致孔劑與聚合物之間溶解度差值的增加，微球的孔徑隨之增大而比表面積呈下降趨勢(shì)。將此類微球偶聯(lián)聚乙烯亞胺衍生為陰離子交換層析介質(zhì)，以前沿分析法比較了不同孔徑的微球的傳質(zhì)性能，其中孔徑為257 nm的介質(zhì)仍能保持較高的動(dòng)態(tài)蛋白載量（45.1 mg/mL），表明此類大孔介質(zhì)在高通量分離純化應(yīng)用方面具有很大潛力。

關(guān)鍵詞 致孔劑； 溶解度參數(shù)； 大孔微球； 蛋白質(zhì)； 分離

1 引 言

人們對(duì)生物制品的需求日益增加，促使生物制藥生產(chǎn)規(guī)模不斷增加，如何高效地獲得符合要求的生物產(chǎn)品，是下游分離純化技術(shù)所面對(duì)的挑戰(zhàn)，因此發(fā)展高通量的分離分析方法勢(shì)在必行。層析分離作為一種主流技術(shù)在蛋白分離純化中占有重要地位，其中色譜層析介質(zhì)是分離柱的核心。當(dāng)前以瓊脂糖為基質(zhì)的介質(zhì)應(yīng)用廣泛，具有生物相容性好、化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，但其缺乏機(jī)械剛性、耐壓性差（通常<0.3 MPa）、孔徑小[1]（孔徑范圍在3～50 nm之間），尤其在分離大尺寸生物分子，如病毒、類病毒顆粒時(shí)，表現(xiàn)出載量低、通量小的不足。而具有大孔結(jié)構(gòu)的聚合物層析介質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度高（可耐受10 MPa以上壓力）、孔徑尺寸大（>100 nm），更適合大尺寸分子的傳質(zhì)，能夠滿足快速、高通量分離純化的需求，可彌補(bǔ)這些不足[2]。

以瓊脂糖為基質(zhì)的介質(zhì)多以懸浮自由基聚合制備而成，控制微球結(jié)構(gòu)從而獲得貫通孔是制備難點(diǎn)。二十世紀(jì)九十年代初出現(xiàn)的顆粒內(nèi)以對(duì)流傳質(zhì)為特征的灌注色譜填料（POROS 系列）[3]，其最大特點(diǎn)為同時(shí)具有貫通孔（500～800 nm）和擴(kuò)散孔（20～100 nm），在保證蛋白分子快速傳質(zhì)的同時(shí)具有較高的蛋白載量。這種介質(zhì)制備過程中先形成納米粒子，然后粒子間進(jìn)行團(tuán)聚從而得到大孔微球，因其制孔過程復(fù)雜而難以準(zhǔn)確控制[4]。Sun研究組[5，6]采用碳酸鈣顆粒和有機(jī)溶劑作為致孔劑制備超大孔PGMA微球，得到具有102 nm孔徑微球，但由于無機(jī)顆粒與有機(jī)聚合物的相容性較差，所得微球的貫通孔不易均勻控制； Zhou等[7，8]研究了以反膠團(tuán)溶脹法制備聚丙烯酸酯類和苯乙烯類為基質(zhì)的超大孔層析介質(zhì)。以上兩種方法均是通過設(shè)計(jì)不同的致孔劑，從而制得貫通孔結(jié)構(gòu)。該類大孔聚合物微球?qū)Φ鞍状蠓肿佑兄^好的傳質(zhì)性能，但同時(shí)其比表面積會(huì)顯著降低，甚至低于10 m2/g，介質(zhì)的蛋白載量難以提升[9，10]。本課題組前期工作中采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合方式制備大孔聚丙烯酸酯類微球，具有200～300 nm的貫通孔[11，12]，同時(shí)具有較高的比表面積，在調(diào)控孔徑及比表面積的過程中發(fā)現(xiàn)，致孔劑對(duì)于微球結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，但對(duì)其影響規(guī)律未做進(jìn)一步研究。

本研究仍分別以甲基丙烯酸縮水甘油醚酯和乙二醇二甲基丙烯酸酯為功能單體和交聯(lián)劑，在傳統(tǒng)懸浮聚合體系中，系統(tǒng)研究了致孔劑組成及用量對(duì)微球的結(jié)構(gòu)包括孔徑大小、比表面積、表面形貌、蛋白載量等的影響，探索了溶解度參數(shù)與微球結(jié)構(gòu)之間的規(guī)律關(guān)系。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

FEI Quanta400F掃描電子顯微鏡（美國(guó)FEI公司）； Autopore IV9500壓汞儀（美國(guó)Micromeritics公司），VSorb 2800比表面積測(cè)定儀（南京金埃譜公司）； KTA Purifier 10 蛋白層析系統(tǒng)（美國(guó)GE公司）。

甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA，純度98%）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，純度98%）、聚乙烯醇（PVA，醇解度87%，平均聚合度1700）、聚乙烯亞胺（PEI分子量600）均為試劑純（阿拉丁試劑公司）； 偶氮二異丁腈（AIBN，分析純）、二氯甲烷（DCM，分析純）、正辛醇（OA，分析純）、十二烷基苯磺酸鈉（SDS，純度99%），國(guó)藥集團(tuán)； 牛血清白蛋白（BSA，試劑級(jí)，純度>98%，美國(guó)SigmaAldrich公司）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 大孔聚合物微球的制備 介質(zhì)采用懸浮聚合方法制備，其反應(yīng)過程如圖1所示，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：（1）配制水相：稱取10 g PVA、1.0 g SDS加入1000 mL去離子水中，水浴加熱至80℃，在磁力攪拌下至完全溶解成透明溶液，冷卻至室溫，備用； （2）配制油相：稱取0.040 g AIBN加入25 mL三角瓶中，然后再依次加入1.0 mL GMA、1.0 mL EDMA、1.5 mL二氯甲烷、1.5 mL正辛醇，在室溫下振蕩15 min混合均勻； （3）在通入氮?dú)獾臈l件下，將油相緩慢滴入水相中， 200 r/min攪拌，滴加完畢后，升溫至60℃反應(yīng)8 h，聚合完畢后，將溶液進(jìn)行抽濾，然后放入索氏提取器，用丙酮抽提24 h，取出在50℃下真空干燥24 h后，室溫下存放，備用。

2.2.2 陰離子交換介質(zhì)的衍生及離子交換容量的測(cè)定 陰離子交換介質(zhì)的制備過程參照文獻(xiàn)[13]方法： 稱取5.0 g干燥的自制大孔微球（PGMAEDMA）置于250 mL三口瓶中，然后依次加入50 mL二甲基亞砜和5.0 g聚乙烯亞胺，攪拌混合均勻后加熱至60℃，反應(yīng)24 h，反應(yīng)完畢后，將溶液抽濾，并用去離子水洗滌至無色，然后放入玻璃層析柱中測(cè)定其離子交換容量[14]，其具體操作如下：（1）首先用30 mL 1.0 mol/L NaOH溶液將介質(zhì)轉(zhuǎn)型為OH型； （2）將去離子水通入層析柱中，清洗介質(zhì)至流出液為中性； （3）準(zhǔn)確量取50 mL 0.10 mol/L加入層析柱中，并同時(shí)收集流出液體； （4）向?qū)游鲋屑尤?0 mL 1.0 mol/L NaCl溶液，將此收集液與步驟（3）的收集液合并； （5）用標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定收集液，根據(jù)下式計(jì)算介質(zhì)的離子交換容量Q。endprint

2.2.3 前沿分析法測(cè)定層析介質(zhì)的蛋白載量 取1.0 mL PGMAEDMAPEI介質(zhì)裝入層析柱管（Φ 10 mm×13 mm）中，將此柱子連接于AKTA Purifier 10蛋白層析系統(tǒng)中。以50 mmol/L TrisHCl緩沖溶液（pH=8.0）為平衡液A，以1.0 mol/L NaCl TrisHCl緩沖溶液（pH=8.0）為洗脫液B，并用平衡液A配制 1.0 mg/mL BSA溶液。色譜條件如下：設(shè)定操作流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，先平衡層析柱10 mL（即10 柱體積，10CV），然后用泵頭上樣方式開始吸附BSA，100%流穿后再以平衡液A沖洗層析柱至基線，最后以洗脫液B洗脫吸附蛋白，根據(jù)流穿體積計(jì)算介質(zhì)動(dòng)態(tài)吸附載量。

3 結(jié)果與討論

3.1 致孔劑中兩組分的比例對(duì)微球形貌的影響

致孔劑對(duì)多孔材料的成孔起著至關(guān)重要的作用。首先考察了致孔劑中兩種組分的不同比例組成對(duì)微球形貌的影響，固定致孔劑的體積用量，改變兩種組分之間的比例。其中二氯甲烷（DCM，δ=9.7 （cal/cm3）1/2）為良溶劑，正辛醇（OA，δ=10.3 （cal/cm3）1/2）為不良溶劑，PGMAEDMA微球的溶解度參數(shù)參照聚甲基丙烯酸甲酯擬定為9.3（cal/cm3）1/2，以上有關(guān)溶解度參數(shù)均參照文獻(xiàn)[15]的數(shù)值，致孔劑二者的體積組成比例分別為2∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2（對(duì)應(yīng)的溶解度參數(shù)依次為9.89、10.0、10.06、10.09 （cal/cm3）1/2），不同比例下的表面形貌變化如圖2所示，DCM/OA為2∶1時(shí)（A1和A2）微球表面致密，幾乎無孔； 當(dāng)降低DCM用量，DCM/OA為1∶1時(shí)（B1和B2），微球表面開始變得粗糙，放大5000倍下的SEM圖（B2）出現(xiàn)100 nm以內(nèi)的大孔； 繼續(xù)降低DCM用量，二者比例為1∶1.5時(shí)（C1和C2），微球表面的孔徑增大至200～300 nm； 隨著DCM用量進(jìn)一步減少，當(dāng)下降為DCM/OA=1∶2時(shí)（D1和D2），微球表面粗糙度顯著，大孔尺寸及數(shù)量均明顯增加，孔之間的通透性增加；繼續(xù)減少DCM的用量（DCM/OA=1∶3），微球破碎嚴(yán)重。微球的表面形貌分析表明，不良溶劑OA用量的增大對(duì)形成大孔有促進(jìn)作用，而良溶劑DCM有利于微球的成球或者機(jī)械強(qiáng)度的提高，此趨勢(shì)與普通的多孔聚合物材料制備規(guī)律相似[16]。

3.2 致孔劑體系的溶解度參數(shù)對(duì)微球內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

不同比例的致孔劑體系的溶解度參數(shù)以及所對(duì)應(yīng)微球的孔徑及比表面積如表1所示。致孔劑體系的溶解度參數(shù)由9.89 （Cal/cm3）1/2增加到10.09 （Cal/cm3）1/2所對(duì)應(yīng)的微球孔徑呈增大趨勢(shì)，最大平均孔徑可達(dá)（257.0±0.2） nm，相反，對(duì)應(yīng)的比表面積為下降趨勢(shì)，從（134±1） m2/g下降至（47±1） m2/g。通常認(rèn)為聚合物的溶解度參數(shù)值與溶劑的溶解度參數(shù)值越接近時(shí)，聚合物越傾向于溶解其中[17]。致孔劑體系與PGMAEDMA微球之間的溶解度差值顯示致孔劑與PGMAEDMA的相容性優(yōu)劣，進(jìn)而影響微球的結(jié)構(gòu)有一定影響，其影響見圖3和圖4。由溶解度參數(shù)差值Δδ對(duì)孔徑的影響趨勢(shì)圖（圖3）可見，隨著差值的增加，微球孔徑呈上升趨勢(shì)，而其比表面積則相反呈下降趨勢(shì)（圖4）。究其原因，溶解度差值Δδ越大，致孔劑與聚合物之間的相容性越差，在聚合過程中生成的聚合物與致孔劑之間的相分離發(fā)生的越早，后期聚合物在早期析出的核上繼續(xù)生長(zhǎng)，形成的聚集顆粒尺寸偏大，聚集顆粒尺寸越大則顆粒間的空隙也隨之增大，因此，最后形成了較大的孔徑。與此同時(shí)，聚集顆粒尺寸越大則對(duì)應(yīng)的比表面積則越低，故微球的比表面積變化呈相反趨勢(shì)。

3.3 不同結(jié)構(gòu)微球的蛋白動(dòng)態(tài)載量測(cè)定

將不同孔徑的微球衍生后制備得到陰離子交換介質(zhì)（PGMAEDMAPEI），分別測(cè)定了其離子交換容量和動(dòng)態(tài)蛋白載量值。從表2可見，隨著介質(zhì)孔徑的增加（21～257 nm），離子交換容量稍有下降，主要是由于介質(zhì)的比表面積降低，致使介質(zhì)表面偶聯(lián)PEI配基的量減少，但此影響并不顯著，介質(zhì)的離子交換容量均保持在0.35 mmol/mL以上?？赡苁墙橘|(zhì)的比表面積雖然降低，但相應(yīng)的孔徑的增加降低了大分子配基PEI的傳質(zhì)以及反應(yīng)位阻，故最終對(duì)偶聯(lián)PEI的數(shù)量沒有顯著影響。

比較了不同孔徑結(jié)構(gòu)的PGMAEDMAPEI的動(dòng)態(tài)載量，通常介質(zhì)孔徑的增大有利于蛋白大分子的傳質(zhì)，但由于比表面積降低，蛋白載量也會(huì)降低，從表2可知，介質(zhì)的動(dòng)態(tài)載量隨著孔徑的增加呈下降趨勢(shì)，從61.4 mg/mL下降至45.1 mg/mL，下降幅度為26.5%，但遠(yuǎn)小于比表面積下降幅度（64.9%），表明此類大孔介質(zhì)一定程度上能夠保持較高載量。

4 結(jié) 論

本研究采用懸浮聚合方法制備了甲基丙烯酸縮水甘油酯與乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚的大孔微球，考察了致孔劑的溶解度參數(shù)對(duì)微球結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，隨著致孔劑中不良溶劑比例的增大，微球的孔徑隨之增加，同時(shí)比表面積呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。致孔劑體系與聚合物之間的溶解度參數(shù)差值越小，微球的孔徑越小， 比表面積越大，相應(yīng)的蛋白載量越高。本研究為聚合物層析介質(zhì)的制備提供了參考。

References

1 Josic' D， Horn H， Schulz P， Schwinn H， Britsch L.J. Chromatogr. A， 1998， 796（2）： 289-298

2 Zhang R Y， Li Q， Li J， Zhou W Q， Ye P L， Gao Y， Ma G H， Su Z G. Mat. Sci. Eng. C， 2012， 32（8）： 2628-2633

3 Hahn R， Schlegel R， Jungbauer A. J. Chromatogr. B， 2003， 790（1）： 35-51endprint

4 Noubar B A， Brookline M， Fred E R， West L I， Robert C D， Norwich J V. US Patent， 5019270， 1991

5 Wu L， Bai S， Sun Y. Biotechnol. Prog.， 2003， 19： 1300-1306

6 Zhang M L， Sun Y. J. Chromatogr. A， 2001， 922（12）： 77-86

7 Zhou W Q， Gu T Y， Su Z G， Ma G H. Polymer， 2007， 48： 1981-1988

8 Zhou W Q， Gu T Y， Su Z G， Ma G H. Eur. Polym. J.， 2007， 43（10）： 4493-4502

9 Svec F， Fréchet J M J. Chem. Mater.， 1995， 7： 707-715

10 Zhou X， Xue B， Bai S， Sun Y. Biochem. Eng. J.， 2002， 11： 13-17

11 ZHANG RongYue， PAN YiTing， JI DeKun， LIU Cai. China Patent， 20151046635465， 2015

張榮月， 潘一廷， 冀德坤， 劉 才. 中國(guó)專利， 2015104635465， 2015

12 YU Tian， XU ChengNan， YU Yuan， ZHAO FeiFei， PAN YiTing， LIU Cai， HUANG YongDong， ZHANG RongYue. Chem. J. Chinese Universities， 2016， 37（9）： 1740-1743

虞 天， 許成楠， 于 嫄， 趙飛飛， 潘一廷， 劉 才， 黃永東， 張榮月. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)， 2016， 37（9）： 1740-1743

13 Zhang R Y， Li Q， Gao Y， Li J， Huang Y D， Song C， Zhou W Q， Ma G H， Su Z G. J. Chromatogr. A， 2014， 1343： 109-118

14 YU Yuan， WU XingLan， LI Yin， HUANG YiKang， JIANG ChengWei， ZHAO FeiFei， WU Jie， ZHANG RongYue. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， 44（12）： 1874-1879

于 嫄， 吳興蘭， 李 尹， 黃逸康， 姜成偉， 趙飛飛， 吳 頡， 張榮月. 分析化學(xué)， 2016， 44（12）： 1874-1879

15 LIU YuTang. Wuhan Huagong， 1994， （3）： 1-21

柳玉堂. 武漢化工， 1994， （3）： 1-21

16 Wu Y G， Dicky A， Giorgio C. J. Chromatogr. A， 2015， 1375： 92-100

17 ZHENG YuYing. Preparation and Characterization of Polymer Microspheres by Disperse Polymerization. Beijing： Science Press， 2017： 15

鄭玉嬰. 聚合物微球分散聚合法制備、結(jié)構(gòu)及性能. 北京： 科學(xué)出版社， 2017： 15

Abstract The macroporous microspheres were prepared through suspension polymerization and based on a copolymer of glycidyl methacrylate and ethylene glycol dimethacrylate. The effect of porogen on the microspheres structure was evaluated in terms of pore size and surface area. Porogen contained dichloromethane （δ=9.7 （cal/cm3）1/2） and Noctanol （δ=10.3 （cal/cm3）1/2） which corresponded to a good and poor solvent， respectively. The solubility parameter of porogen was controlled in the range of 9.89-10.09 （cal/cm3）1/2. The pore size of microspheres increased with the difference value of solubility parameter between the polymer and the porogen. On the contrary， the surface area of microspheres decreased in this study. The anion exchange media was prepared through coupling poly（ethylene imine） in the microspheres， and the proteins transport was determined by frontal analysis method. The macroporous microspheres with 257 nm pore size could still afford a high proteins capacity （45.1 mg/mL）. These macroporous supports showed a large potential in a rapid separation of proteins.

Keywords Porogen； Solubility parameter； Macroporous microspheres； Protein； Separation

（Received 7 October 2017； accepted 21 November 2017）

This work was supported by Beijing Natural Science Foundation， China （No. 2162013）.endprint