超高效液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜測定沉積物中6種對羥基苯甲酸酯及其代謝產(chǎn)物

趙佳慧

摘 要 建立了一種測定沉積物中6種對羥基苯甲酸酯類化合物及其代謝產(chǎn)物對羥基苯甲酸的定量分析方法。樣品用甲醇水（5∶3，V/V）混合液進行兩次提取，經(jīng)Oasis MCX固相萃取柱凈化，采用UPLC HSS T3色譜柱分離，以甲醇0.1%（V/V）甲酸溶液為流動相進行梯度洗脫，在多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下進行定性分析，內(nèi)標法進行定量分析。結(jié)果表明，7種目標物質(zhì)在0.1～500.0 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（r≥0.9995），方法定量限為0.75～1.23 ng/g，回收率為65.5%～88.3%，相對標準偏差為7.4%～13.6%。本方法前處理簡單，靈敏度高，選擇性好，可用于沉積物中對羥基苯甲酸酯類化合物的測定。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜； 對羥基苯甲酸酯； 沉積物

1 引 言

對羥基苯甲酸酯（Parabens），又稱尼泊金酯，具有惰性、低毒、低刺激性、低敏感性、廣譜抗菌活性、防腐效果不易受pH值影響等特點[1]，已被廣泛用于食品、藥品及化妝品等防腐方面[2]。Darbre等[3]在人體乳腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)了對羥基苯甲酸酯； 體內(nèi)實驗和體外實驗指出對羥基苯甲酸酯具有雌激素活性[4，5]； Crinnion等[6]則發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸酯會影響內(nèi)源性雌激素的代謝，并可導(dǎo)致線粒體功能障礙。這些研究使人們對對羥基苯甲酸酯的低毒性這一觀點產(chǎn)生了質(zhì)疑，國標對食品及化妝品等樣品中對羥基苯甲酸酯進行了相關(guān)限量規(guī)定：對羥基苯甲酸（pHB）及其鹽類在食物中的最大用量為0.012～0.5 g/kg[7]，在化妝品中單酯用量不超過0.4%，混合酯用量不超過0.8%[8]。

由于對羥基苯甲酸酯在世界范圍內(nèi)的廣泛使用， 在土壤、地表水、沉積物、室內(nèi)空氣和灰塵以及生物體中均可檢測到對羥基苯甲酸酯的存在[9]， 且由于對羥基苯甲酸酯可抗微生物降解，可導(dǎo)致其在環(huán)境沉積物中積累[10]； 沉積物是底棲生物的主要食物來源及生活場所，是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[11]，對羥基苯甲酸酯可能對這些水生生物產(chǎn)生影響。

對羥基苯甲酸酯的測定方法主要有毛細管膠束電動色譜法[12]、高效液相色譜法[13]、毛細管色譜法[14]等。張群林等[15]的研究表明，對羥基苯甲酸酯的色譜測定技術(shù)已經(jīng)有較大的進展，其中較為成熟的是高效液相色譜法，但是相對于色譜質(zhì)譜聯(lián)用法而言，后者具有更優(yōu)的靈敏度和選擇性； 目前關(guān)于對羥基苯甲酸酯的測定方法大多集中在食品、藥品及化妝品等方面，所以建立一種高效、快捷、靈敏的測定沉積物中對羥基苯甲酸酯的定量方法很有必要。本研究采用超高效液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜串聯(lián)， 建立了一種選擇性好、靈敏度高的測定沉積物中對羥基苯甲酸酯的定量方法，具有準確快速等特點，可用于同時測定沉積物中多種對羥基苯甲酸酯。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

1290/6460超高效液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜（美國Agilent公司）； UPLC HSS T3色譜柱（美國Waters公司） ； KDC2044低速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）； HZQX160恒溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠）； NDK24W水浴氮吹儀（上海皓莊儀器有限公司）； RE2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）； Sartorius BS124S電子天平（德國Sartorius公司）； SPE固相萃取裝置（美國Supelco公司）； Oasis MCX柱（60 mg，3 mL，美國Waters公司）； 針孔過濾器（尼龍，孔徑0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

對羥基苯甲酸甲酯（MeP）、乙酯（EtP）、丙酯（PrP）、丁酯（BuP）、庚酯（BzP）、芐酯（HeP）以及對羥基苯甲酸（pHB）標準品（美國Accustandard公司）； 內(nèi)標13C6MeP（純度為99%，美國劍橋同位素實驗室公司）； 甲酸（HPLC級，美國Dikma公司）； 甲醇（HPLC級，美國TEDIA公司）。實驗用水為某品牌純凈飲用水。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準液的配制 準確稱取標準物質(zhì)（包括MeP、EtP、PrP、HeP、BzP和pHB）100.0 mg，用甲醇溶解并定容于25 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為4000 mg/L的標準儲備液； 準確稱取1.000 g BuP，用甲醇溶解并定容至25 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為40000 mg/L的標準儲備液。分別取適量標準儲備液，用甲醇配制成濃度范圍為0.1～500 μg/L的混合標準溶液，于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 樣品的采集 從淮河上游采集沉積物樣品，將其放置于不銹鋼飯盒中。運回實驗室自然風(fēng)干，研磨， 過70目篩后， 置于棕色廣口瓶中避光保存。

2.2.3 樣品前處理及方法改進 樣品前處理參考文獻[16，17]，并將其改進。具體操作步驟如下：稱取2 g沉積物于玻璃離心管中，加入5 mL甲醇水（5∶3，V/V）混合溶液后，放入恒溫振蕩箱中以200 r/min的速度振蕩提取60 min，再加入3 mL甲醇水（5∶3，V/V）混合溶液進行二次提取，混合兩次提取的上清液，使用氮吹儀氮吹至4 mL，然后用0.2%（V/V）甲酸溶液稀釋至10 mL，轉(zhuǎn)移至已用5 mL甲醇和5 mL純水活化的Oasis MCX固相萃取柱中，用5 mL甲醇洗脫Oasis MCX固相萃取柱，收集洗脫液，旋蒸至近干后用甲醇定容至1 mL，過0.22 μm濾膜并加入內(nèi)標13C6MeP，用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進行測定。

3 結(jié)果與討論

3.1 7種目標物質(zhì)質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜串聯(lián)使用實現(xiàn)目標樣品的測定，在ESI 模式下分別對目標物質(zhì)的標準溶液進行母離子掃描，確定其準分子離子并不斷優(yōu)化碰撞電壓和碰撞能量，從而確定定量離子與定性離子，最終按照多反應(yīng)監(jiān)測模式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)。質(zhì)譜參數(shù)為：毛細管電壓為3500 V， N2作為碰撞氣，溫度為340℃，流速為11 L/min，噴霧針的壓力為275.8 kPa，MS1和MS2的溫度均設(shè)置為100℃，掃描模式采用多反應(yīng)檢測，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如表1所示。endprint

3.2 色譜條件的優(yōu)化

色譜柱選用UPLC HSS T3柱（100 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），參照文獻[16]確定甲醇和0.1%甲酸溶液為流動相，采用梯度洗脫[18]。調(diào)節(jié)流動相的比例及目標物出峰時間，確定最佳的梯度洗脫條件如表2所示，色譜圖如圖1所示。 由圖1可知，各目標物得到有效分離，并且測定時間控制在10 min內(nèi)。

3.3 方法的改進

按照參考文獻[16，18]的方法對樣品進行凈化處理，7種目標物質(zhì)的回收率結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，7種目標物質(zhì)回收率在1.22%～133.54%之間，差別較大，只有對羥基苯甲酸甲酯的回收率較高，其余6種目標物質(zhì)均較低，其中代謝產(chǎn)物對羥基苯甲酸回收率最低，只有1.22%，原因可能是凈化步驟中使用水進行淋洗，而pHB的水溶性較強，故在此步驟中容易流失。

為了提高目標物質(zhì)的回收率，本研究將提取過的樣品加入活化好的Oasis MCX柱中后，直接使用甲醇進行洗脫（省略水淋洗步驟），將兩次回收率結(jié)果進行對比。由表3可知，加標濃度200 ng/g， 除對羥基苯甲酸甲酯的回收率較改進前降低外，其余6種目標物的回收率較改進前均有提高。根據(jù)方法改進前后回收率的對比結(jié)果可知，改進后的方法更利于對羥基苯甲酸酯及其代謝產(chǎn)物pHB的測定。

3.4 目標物質(zhì)的線性范圍及方法定量限

在優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件下，將配制好的混合標準樣品按濃度從低到高的順序測定進樣，以目標組分的峰面積為Y軸，質(zhì)量濃度（μg/L）為X軸繪制標準曲線，質(zhì)量濃度在0.1～500.0 μg/L之間線性關(guān)系良好，7種目標物質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999， 滿足實驗室的分析要求，方法的線性范圍及定量限見表4。

3.6 UPLCMS/MS法與其方法的特征比較

王亮等[19]利用GC/MS測定污水中對羥基苯甲酸酯的回收率為78.3%～127.3%，相對標準偏差4.4%～21.2%，本方法與之相比，回收率略低，但相對標準偏差略優(yōu)，并且本研究使用UPLCMS/MS不用進行樣品的衍生化，簡化了樣品的前處理過程； 國標法[20，21]中使用高效液相色譜法紫外檢測器對對羥基苯甲酸酯鹽類的含量進行測定，但紫外檢測器的靈敏度相對較低，較難測定低含量的樣品；而UPLCMS/MS的高靈敏度使其可用于測定低含量的對羥基苯甲酸酯。

3.7 實際樣品的分析

應(yīng)用本方法測定了 2014 年4 月采集的淮河南段表層沉積物中對羥基苯甲酸酯類及其代謝產(chǎn)物的含量。由表6可知， 河段沉積物中共檢出5種目標物，BzP和HeP未檢出。5種檢出目標物中， pHB的含量最高， 達到36.5～271 ng/g， EtP的含量較低，為0.90～2.69 ng/g。

References

1 REN Lu， FANG JianZhang， LONG Fei， LU Ping， LIU GuiHua， ZHANG JianQing， LU ShaoYou. Asian J. Ecotoxicol.， 2016， 11（1）： 261-267

任 璐， 方建章， 龍 飛， 盧 平， 劉桂華， 張建清， 陸少游. 生態(tài)毒理學(xué)報， 2016， 11（1）： 261-267

2 ZHOU JianKe， SONG Ge， LIU RuiYing， ZHANG MingCui. J. Hebei Univ.（Nat. Sci. Ed.）， 2010， 30（4）： 385-389

周建科， 宋 歌， 劉瑞英， 張明翠. 河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2010， 30（4）： 385-389

3 Darbre P D， Aljarrah A， Miller W R， Coldham N G， Sauer M J， Pope G S. J. Appl. Toxicol.， 2004， 24（1）： 5-13

4 Soni M G， Carabin I G， Burdock G A. Food Chem. Toxicol.， 2005， 43（7）： 985-1015

5 Darbre P D， Harvey P W. J. Aappl. Toxicol.， 2008， 28（5）： 561-578

6 Crinnion W J. Altern. Med. Rev.， 2010， 15（3）： 190-196

7 National Food Safety Standard for Uses of Food Additives. National Standards of the People′s Republic of China. GB/T 203882006

食品安全國家標準 食品添加劑使用標準， 中華人民共和國國家標準. GB/T 27602011

8 Safety and Technical Standards for Cosmetics. State Food and Drug Administration（2015）

化妝品安全技術(shù)規(guī)范， 國家食品藥品監(jiān)督管理總局（2015年版）

9 LIU Hui， XU Cheng， LIU Qian， GU AiHua. J. Hyg. Res.， 2016， 45（1）： 155-158

劉 慧， 徐 誠， 劉 倩， 顧愛華. 衛(wèi)生研究， 2016， 45（1）： 155-158

10 Nunez L， Tadeo J L， GarciaValcarcel A I， Turiel E. J. Chromatogr. A， 2008， 1214： 178-182endprint

11 ZHU LingYan， LIU NanNan， DENG BaoLe. Chinese J. Appl. Ecol.， 2009， 20（10）： 2574-2580

祝凌燕， 劉楠楠， 鄧保樂. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報， 2009， 20（10）： 2574-2580

12 SHEN Juan， ZHANG HaiYan， CHU ChengDing， REN LingLing， LIANG ChunMei. Chinese J. Anal. Lab.， 2013， 32（11）： 88-92

沈 娟， 張海燕， 儲成頂， 任玲玲， 梁春梅. 分析試驗室， 2013， 32（11）： 88-92

13 CAO ShuRui， LIU ZhiYong， ZHANG Lei， LI XianLiang， WANG GuoMin， TANG BoBin， YUAN Ruo. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（4）： 529-533

曹淑瑞， 劉治勇， 張 雷， 李賢良， 王國民， 唐柏彬， 袁 若. 分析化學(xué)， 2012， 40（4）： 529-533

14 BAO ZhongDing， XU RongFei， XU RongNian， GU XiuYing. Chinese J. Anal. Chem.， 2004， 32（2）： 270

鮑忠定， 許佳飛， 許榮年， 顧秀英. 分析化學(xué)， 2004， 32（2）： 270

15 ZHANG QunLin， LIU Yi， LI Jun， CHEN YuanZhu. Anhui Med. Pharmaceut. J.， 2006， 10（4）： 241-244

張群林， 劉 毅， 李 俊， 陳元柱. 安徽醫(yī)藥， 2006， 10（4）： 241-244

16 Gatidou G， Thomaidis N S， Stasinakis A S， Lekkas T D. J. Chromatogr. A， 2007， 1138： 32-41

17 Liao C Y， Lee S， Moon H B， Yamashita N， Kannan K. Environ. Sci. Technol.， 2013， 47： 10895-10902

18 WANG Juan， FAN BiWei， XU ShuXia. Food Sci.， 2008， 29（7）： 328-331

汪 雋， 范必威， 許淑霞. 食品科學(xué)， 2008， 29（7）： 328-331

19 WANG Liang， MAO QianHui， YUAN ShouJun， HUANG DeYing， ZHANG JiDe. Environ. Chem.， 2016， 35（1）： 49-56

王 亮， 毛茜慧， 袁守軍， 黃德英， 張繼德. 環(huán)境化學(xué)， 2016， 35（1）： 49-56

20 National Food Safety Standard for Food Additives： Methylparaben Sodium. National Standards of the People′s Republic of China. GB 306012014

食品安全國家標準 食品添加劑 對羥基苯甲酸甲酯鈉. 中華人民共和國國家標準. GB 306012014

21 National Food Safety Standard for Food Additives： Ethylparaben Sodium. National Standards of the People′s Republic of China. GB 306022014

食品安全國家標準 食品添加劑 對羥基苯甲酸乙酯鈉. 中華人民共和國國家標準. GB 306022014

Abstract A new method for simultaneous determination of six benzoic acid esters and their metabolite phydroxybenzoic acid （pHB） in sediments was developed. The samples were extracted with methanol and water， and then the extraction was purified by Oasis MCX solid phase column. The separation of targets was conducted by passing through a UPLC HSS T3 column with a methanol0.1% acid aqueous solution as the mobile phase under gradient elution. The qualitative analysis of the analytes was measured by Ultra performance liquid chromatographyTriple quadrupole tandem mass under multiple reaction monitoring mode （MRM） and the internal standard method was applied for quantitative analysis. The results indicated that seven target substances had a good linear relationship in the range of 0.1-500 μg/L with correlation coefficients above 0.9995 and the detection limits of 0.75-1.23 ng/g. The recoveries ranged from 65.5% to 88.3% and the relative standard deviation was 74%-136%. This method was suitable for the measurement of benzoic acid esters with the advantages such as simple processing， good selectivity and high sensitivity.

Keywords Ultra performance liquid chromatographytriple quadrupole tandem mass spectrometry； Benzoic acid esters； Sediment

（Received 25 May 2017； accepted 10 October 2017）endprint