多菌靈與3種環(huán)糊精的識別研究

孫偉厙

摘 要 利用溶液法制備了疏水性藥物分子多菌靈與β環(huán)糊精、2羥丙基β環(huán)糊精和2，6二甲基β環(huán)糊精的包合物，在25℃時，通過核磁共振實驗氫譜、二維ROESY和擴散排序DOSY的實驗方法對多菌靈與3種環(huán)糊精的識別進行研究，得出了包合物的可能包合形式和3種環(huán)糊精與多菌靈包合后的擴散系數(shù)分別為DβCD=2.516×10 10 m2/s，D2HpβCD=1.676×10 10 m2/s，DMeβCD=2.046×10 10 m2/s； 通過X射線粉末衍射、熱重分析、紅外光譜和掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，形成包合物后，環(huán)糊精和多菌靈的特征衍射峰均發(fā)生了變化，多菌靈的特征衍射峰10.4°，21.2°，25.8°，31.5° （2θ）消失或減弱； 多菌靈熱分解溫度197.5℃，形成包合物后熱分解溫度提高到260℃以上； 紅外光譜的結(jié)果也表明，形成包合物后，環(huán)糊精空腔內(nèi)的水峰振動明顯減弱，說明環(huán)糊精的疏水空腔中水分子位置被多菌靈分子占據(jù)； 掃描電鏡的結(jié)果表明，包合物的外觀不同于單體，說明有新的物相生成。

關(guān)鍵詞 多菌靈； 環(huán)糊精； 核磁共振； 包合物

1 引 言

多菌靈（Carbendazim， MBC）又名苯并咪唑44號[1]，是一種高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，其主要作用機制是通過活性苯并咪唑部位抑制DNA合成，從而抑制菌體的生物合成。多菌靈能夠有效防治由多種真菌引起的病害，如西紅柿枯萎病、蔬菜苗期立枯病、猝倒病、 瓜類白粉病、豆類炭疽病等。由于多菌靈不溶于水，作為農(nóng)藥使用時一般被制成可濕性粉劑，懸浮劑，或水分散粒劑，因此在使用過程中殘留量大、利用率低，易對土壤造成污染[2，3]。

環(huán)糊精[4]具有特殊的疏水空腔，可以包合與之空腔尺寸相匹配的客體小分子，形成的包合物是一種特殊類型的分子復(fù)合物，其疏水空腔可以包合客體分子的疏水部分，改變客體小分子的物化性質(zhì)[5，6]。多菌靈是疏水性有機小分子，其分子大小與環(huán)糊精空腔尺寸匹配，使用環(huán)糊精對其進行包合能夠有效改變客體分子多菌靈的物化性質(zhì)，提高其水溶性和生物利用度，降低對環(huán)境的污染。

核磁共振（NMR）在分子識別的研究方面具有很多優(yōu)點，它可以在近似生理環(huán)境下對樣品進行無損檢測，測試方法具有多樣性，如一維氫譜、碳譜[7]、二維旋轉(zhuǎn)坐標系NOE譜（ROESY）[8，9]、擴散排序?qū)嶒灒―OSY）等[10]，能夠提供豐富的實驗參數(shù)，如化學位移、耦合常數(shù)、質(zhì)子強度、弛豫時間和擴散系數(shù)等。同時，核磁共振方法在確定主客體空間構(gòu)型中具有十分重要的作用。

已有文獻報道使用熒光方法研究MBC與環(huán)糊精包合物在溶液狀態(tài)下的識別現(xiàn)象，并采用熱重（TG） [11，12]、 X射線粉末衍射（XRD） [13，14]、紅外光譜（IR） [15，16]和掃描電鏡（SEM）等方法研究固體包合物的性質(zhì)。

本研究采用溶液法制備了MBC與β環(huán)糊精（βCD）、2羥丙基β環(huán)糊精（2HpβCD）和2，6二甲基β環(huán)糊精（MeβCD）的包合物，通過1H NMR分析了MBC進入環(huán)糊精空腔后的主客體化學位移變化，利用2D ROESY分析了包合物可能的空間構(gòu)型，對其可能的作用點進行了分析和討論，多菌靈和環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)見圖1。此外，利用2D DOSY的實驗方法對包合物的擴散系數(shù)進行了測試，利用熱重（TG）、 X射線粉末衍射（XRD）、紅外光譜（IR）和掃描電鏡（SEM）的方法，對包合物的性質(zhì)進行了研究。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AVANCE III 400MHz超導(dǎo)核磁共振儀（德國Bruker公司）； STA 449C熱重分析儀（德國Netzsch公司馳）； D/MAX3C粉末衍射儀（日本Rigaku公司）； EQUINOX55紅外光譜儀（德國Bruker公司）； S570掃描電鏡（日本Hitachi公司）； BSA124S分析天平（德國Sartorius公司）； SENCOR旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）； KQ3200ED超聲波振蕩器（昆山市超聲波儀器有限公司）； RCT basic磁力攪拌器（德國IKA公司）； 1011AB電熱鼓風干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）； FGJ10c冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）。

MBC （純度>98%）、βCD（分子量=1135）、2HpβCD （分子量=1542，DS=5.5）和MeβCD （分子量=1310，DS=12）均購買于上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司； 核磁試管（Φ5 mm， ST500， NORELL）； D2O （D，99.8%， CIL）、DMSO （D，99.8%， CIL）、無水乙醇（分析純，天津富宇精細化工有限公司）。

2.2 實驗方法

NMR實驗由BBO5mm多核寬帶探頭測試，配控溫單元（VTU），實驗溫度（293 ± 0.1） K，樣品溶于D2O，以溶劑殘留峰為化學位移定標標準。1H NMR工作頻率為400.13，H譜寬為8012.82 Hz，1H譜脈沖寬度9.6 μs，采用zg30脈沖序列，采樣點數(shù)65536，采樣次數(shù)16次，延遲時間1 s； 2D ROESY采用儀器自帶標準脈沖序列，F(xiàn)2 （1H）和F1 （1H）維的譜寬均為3616.1 Hz，混合時間0.8 s，采樣數(shù)據(jù)點陣t2 × t1=2048 × 256； DOSY實驗采用Ledbpgp2s脈沖序列，梯度場分16步由2%遞增到95%，譜寬均為5208.33 Hz， 采樣次數(shù)16次，空掃次數(shù)4次，延遲時間1 s； DOSY實驗數(shù)據(jù)采用Topspin3.2軟件進行數(shù)據(jù)擬合，其它實驗數(shù)據(jù)使用MestReNova 7.1軟件進行繪圖。

MBC、βCD、 2HpβCD、 MeβCD、 物理混合物、 包合物XRD分析均用Cu靶，Kα（λ=0.15406 nm） 電流35 mA，激發(fā)電壓35 kV， 2θ掃描范圍5°～50°， 掃描速度4°/min，步長0.02°/min。endprint

對于熱重分析，MBC、 βCD、 2HpβCD 、 MeβCD、 物理混合物、 包合物分別進行研磨，制樣。實驗起始溫度： 35℃，10℃/min程序升溫至600℃，氮氣保護。氮氣作為保護氣流，流速40 mL/min，升溫速率10℃/min，溫度范圍30～600℃。

IR光譜測定采用KBr壓片，置于傅立葉變換紅外光譜儀檢測器中進行測定，掃描波數(shù)范圍為4000～500 cm1。SEM掃描采用噴金方法，激發(fā)電壓20 kV，放大倍數(shù)500倍。

2.3 多菌靈與環(huán)糊精包合物的制備方法

稱取0.5 mmol 環(huán)糊精至30 mL二次蒸餾水中，將0.5 mmol MBC溶于20 mL無水乙醇中。 使用100 mL 三頸瓶，控制反應(yīng)溫度40℃，攪拌速度500 r/min，將MBC的乙醇溶液緩慢滴加到環(huán)糊精溶液中，滴加完成后，升溫至60℃，攪拌24 h，恢復(fù)室溫繼續(xù)攪拌12 h，減壓蒸餾除去大部分乙醇，靜置過夜，采用冷凍干燥法，得到類白色疏松固體包合物。

3 結(jié)果與討論

3.1 1H NMR的分析

MBC的1H NMR如圖2所示， δ 3.755是一個單峰，歸屬為H10甲基質(zhì)子， δ 7.387～7.409是苯環(huán)上H4/H7質(zhì)子， δ 7.060～7.083是苯環(huán)上H5/H6質(zhì)子， δ 11.649是活潑氫NH。

MBC不溶于水，使用D2O作溶劑時，在氫譜中有MBC苯環(huán)區(qū)的特征峰出現(xiàn)； 同時，環(huán)糊精的腔內(nèi)質(zhì)子不同程度向高場移動，峰型發(fā)生改變，說明MBC與環(huán)糊精形成了包合物，增大了MBC的水溶性。環(huán)糊精的腔內(nèi)質(zhì)子H3和H5受到MBC苯環(huán)的各向異性效應(yīng)影響，化學位移向高場移動，3種環(huán)糊精質(zhì)子包合前后的化學位移變化見表1。如圖3所示，與環(huán)糊精形成包合物后，MBC苯環(huán)區(qū)質(zhì)子H4/H7與H5/H6峰型變鈍，底部變寬，兩組峰之間的距離發(fā)生變化： MBCβCD包合物，兩峰之間的距離由包合前的Δδ 0.326變化到Δδ 0.165； MBC2HpβCD包合物，兩峰之間的距離變化到Δδ 0.175； MBCMeβCD包合物，兩峰之間的距離變化到Δδ 0.133。MBC不溶于水，無法將MBC游離態(tài)與包合態(tài)的化學位移變化進行比較，但仍能夠通過MBC自身質(zhì)子的化學變化說明形成包合物后所產(chǎn)生的變化。

3.2 2D ROESY分析

MBC的苯環(huán)區(qū)質(zhì)子與βCD的H3和H5有相關(guān)峰（圖4），而MBC與βCD的環(huán)外質(zhì)子H2和H4沒有相關(guān)峰，說明MBC的苯環(huán)進入到了βCD的空腔內(nèi)，二者之間的空間距離較近，MBC的H4/H7與βCD的H3和H5都有相關(guān)峰，而MBC的H5/H6只與βCD的H5有相關(guān)峰，說明MBC進入到βCD空腔較深，MBC的苯環(huán)位于βCD空腔的中間位置，從圖4中沒有觀察到MBC的甲基與βCD的相關(guān)峰，這可能是由于該部分沒有進入到βCD的空腔，仍留在空腔的大口端外部，2HpβCD和MeβCD與MBC的ROESY譜圖見附錄圖1和圖2（見電子版文后支持信息）， 由此得出MBC與3種環(huán)糊精的可能包合形式如圖5所示。

3.4 TG分析

從圖7可見，βCD有兩個失重階段，第一個階段是從56.5℃開始失重，到97.9℃失重結(jié)束，這一階段主要是βCD失水過程，此后不再失重，第二階段是從285.1℃開始失重，371.8℃失重結(jié)束，這一階段是βCD的熱分解過程，失重率71.6%，此后直到600℃，殘留量不在變化； MBC有一個失重過程，從197.5℃開始失重，350.68℃失重結(jié)束，失重率為95.5%； βCD與MBC混合物有3個失重階段，分別是失水階段、 MBC熱分解階段、 βCD熱分解階段，混合物并沒有提高MBC的分解溫度； βCDMBC包合物有兩個失重階段，第一個階段是失水階段，第二個階段在261.1℃以前，一直是一個很緩慢的失重過程，總失重率5.3%，這一階段是受熱后，部分MBC緩慢從βCD空腔釋放的過程，261.1℃后，βCDMBC包合物開始分解，到383.6℃結(jié)束，失重率70.1%， βCDMBC的包合物不同于二者的混合物，又有區(qū)別與二者的單體，表明二者生成了新的物相，βCD與MBC形成包合物后，熱穩(wěn)定性明顯提高，同樣MBC與2HpβCD形成包合物后，在263.4℃開始分解，436.6℃結(jié)束，失重率82.3%，MBC與MeβCD形成包合物后，在265.9℃開始分解，到372.2℃結(jié)束，失重率62.1% （附錄圖5，圖6，見電子版文后支持信息）。

3.5 XRD分析

由圖10A可見，MBC在未被包合之前，呈現(xiàn)松散的顆粒狀； 圖10B中，環(huán)糊精的外表形具有一定的規(guī)則，其中βCD呈現(xiàn)立方體，2HpβCD， MeβCD呈現(xiàn)球狀； 在圖10C中能夠看到MBC與環(huán)糊精物理混合物各自的形態(tài)； 在圖10D中，MBC被環(huán)糊精包合后，外觀形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，表明生成了新的物相。

4 結(jié) 論

本研究通過溶液法制備了MBC與βCD、 2HpβCD和MeβCD 的包合物。利用一維氫譜、 二維ROESY譜和DOESY技術(shù)，建立了一種定性分析疏水性客體分子MBC與環(huán)糊精包合物的方法。1H NMR分析表明MBC進入到環(huán)糊精的疏水空腔內(nèi)，受到疏水空腔的影響，MBC質(zhì)子的化學位移發(fā)生變化。2D ROESY證明了包合物的空間構(gòu)型為苯環(huán)靠近環(huán)糊精的小口端，咪唑環(huán)在環(huán)糊精的大口處，烷烴鏈部分在大口端的外部； DOSY實驗中MBC的擴散系數(shù)明顯下降，說明MBC的表觀分子量增大，與環(huán)糊精形成了包合物； 紅外譜圖中MBC特征峰消失或發(fā)生變化； X射線粉末衍射中新衍生峰的出現(xiàn)以及掃描電鏡揭示的包合物的外貌形態(tài)的變化，均表明MBC與3種環(huán)糊精之間形成了包合物，熱重分析表明MBC與環(huán)糊精形成包合物后，MBC的熱穩(wěn)定性明顯提高。

Referencesendprint

1 YOU Juan， GUO HongBin， ZENG ShaoDong， LIU YuanJing， WANG MingYue. Agrochemicals， 2016， 55（12）： 859-862

尤 娟， 郭宏斌， 曾紹東， 劉元靖， 王明月. 農(nóng)藥， 2016， 55（12）： 859-862

2 CUI LiLi， YAN MeiXia， WANG ChunWei， XU YunCheng， WANG Yan， GAO Jie. Journal of Analytical Science， 2015， 31（2）： 223-227

崔麗麗， 閆梅霞， 王春偉， 許允成， 王 燕， 高 潔. 分析科學學報， 2015， 31（2）： 223-227

3 TAN XiaoXin， LI Nan， LI Xiang， SHI HongMei， XU XiangDong， LIAN KaoQi， KANG WeiJun. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2016， 35（8）： 874-879

檀笑昕， 李 楠， 李 享， 石紅梅， 徐向東， 連靠奇， 康維鈞. 分析試驗室， 2016， 35（8）： 874-879

4 Szejtli， J. Chem. Rev.， 1998， 98（5）： 1743-1753

5 YANG ChunXue， ZHU WeiGuo， JIANG Song， LI XinJian， ZOU DaPeng. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（3）： 478-481

楊春雪， 朱衛(wèi)國， 姜 松， 李新建， 鄒大鵬. 分析化學， 2012， 40（3）： 478-481

6 Chen Y， Liu Y. Chem. Soc. Rev.， 2010， 39（22）： 495-505

7 Tiphaine R F， Nathalie A， Laurence G， Goossens J F， Danel C. Carbohyd. Polym.， 2015， 115： 598-604

8 LI JianXin， HUA Jia， HE CuiCui， ZHAO JianWei. Chinese J. Anal. Chem.， 2007， 35（7）： 988-992

李建新， 華 嘉， 何翠翠， 趙健偉. 分析化學， 2007， 35（7）： 988-992

9 Zhang J Q ， Wu D ， Jiang K M ， Zhang D， Zheng X， Wan C P， Zhu H Y， Xie X G， Jin Y， Lin J. Carbohy. Res.， 2015， 406： 55-64

10 Kiraly P， Swan Iain， Nilsson M， Morris G. A. J. Magn. Reson，. 2016， 270： 24-30

11 Sun W， Wang Z H ， She M Y， Yang Z， Jin X L， Wang Y Q， Shi Z， Li J L. Chinese Chem. Lett.， 2016， 27（7）： 1077-1082

12 Bai Y X ， Wang J P ， Bashari M， Hu X T， Feng T ， Xu X M， Jin Z Y， Tian Y Q. Thermochim. Acta， 2012， 541： 62-69

13 Tang P X， Li S S， Wang L L， Yang H Q， Yan J， Li H. Carbohyd. Polym.， 2015， 131： 297-305

14 Periasamy R， Kothainayaki S， Sivakumar K. J. Mol. Struct.， 2015， 1100： 59-69

15 Krishnan S， Thambusamy S. Spectrochim. Acta A， 2014， 130： 105-115

16 Mangolim C S， Moriwaki C， Nogueira A C， Sato F， Baesso M L， Neto A M， Matiol G. Food. Chem.， 2014， 153： 361-370

17 Soliman K A， Ibrahim H K， Ghorab M M. Int. J. Pharmaceut.， 2016， 512： 168-177

18 Huang Y N， Zu Y G， Zhao X H， Wu M F， Feng Z Q， Deng Y P， Zu C， Wang L L. Int. J. Pharmaceut.， 2016， 511： 921-930

Abstract Hydrophobic medicine carbendazim， come into inclusion compounds with βcyclodextrin （βCD）， 2hydroxypropylβCD （2HpβCD） and 2，6dimethylβCD （MeβCD）， were made by solvent method. By investigating the inclusion behaviors of these three cyclodextrins combined with carbendazim using 1H NMR， 2D rotating frame overhause effect spectroscopy （ROESY） and diffusion ordered spectroscopy， the possible ways of combinations and the recognition ratio of this three inclusion compounds， DβCD=2.516×10 10 m2/s， D2HpβCD=1.676×10 10 m2/s， DMeβCD=2.046×10 10 m2/s， were obtained. According to Xray power diffraction， thermogravimetric analysis， infrared spectroscopy and scanning electron spectroscopy characterization， it was found that the characteristic diffraction peaks changed after carbendazim and cyclodextrin formed into inclusion compounds， and the characteristic diffraction peak of carbendazim at 10.4°， 21.2°， 25.8°， 31.5°（2θ） lost or disappear. The pyrolysis temperature of carbendazim was 197.5℃， and would be higher than 260℃ after it formed inclusion complex. The infrared spectrum also showed that the oscillation peaks of inner cyclodextrin cavum apparently reduced after carbendazim combined， which demonstrated that the position of water molecules inside cyclodextrin cavum were occupied by the carbendazim molecules. With the help of SEM， the appearances of inclusion were different from a single carbendazim molecule， which manifested a new structure appeared.

Keywords Carbendazim； Cyclodextrins； Nuclear magnetic resonance； Inclusion

（Received 13 April 2017； accepted 13 October 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21572177， 21673173， J1210057） and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province， China （Nos. 2015J003， 2016JZ004）.endprint