桑葉脫氧野尻霉素的提取及其特性

薛 婷 婷， 孫 慶 元， 王 化 旋， 張 洪 達

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是哌啶類多羥基生物堿，廣泛存在于桑樹的各個組織中，其中桑葉中含量最高[1-2]。DNJ可作為腸道葡萄糖苷酶的抑制劑[3]，抑制餐后血糖濃度的急劇升高[4-5]。傳統(tǒng)煎藥法即水提法，簡單、經(jīng)濟，但DNJ得率低，同時浸取出水溶性糖類、蛋白等雜質(zhì)較多，給后續(xù)純化帶來困難[6]。酸提取法是利用DNJ為生物堿類化合物與酸形成可溶性鹽的特性，DNJ從植物細胞壁滲出[7]，同時酸溶液可使植物細胞壁軟化，因此，DNJ的提取率明顯提高，但受酸的影響提取液濃縮比較困難。有機溶劑提取法是目前提取DNJ常用的方法[8]，一般選用與水互溶的有機溶劑，這種方法提取效率高，而且提取液不易發(fā)霉變質(zhì)[9]，但高毒有機溶劑的殘留影響了DNJ的應(yīng)用。本研究選用低毒、環(huán)保、可回收的乙醇浸提法[10]，對所提取的DNJ特性進行分析，以期為DNJ的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

桑葉，采自金州華家村；DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，上海金穗生物科技有限公司，純度大于99%；蔗糖酶，上海百福進出口貿(mào)易公司；Wagner試劑；DNS；醋酸、醋酸鈉、乙醇、稀硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、蔗糖、石油醚、正丁醇、活性炭等均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 最大吸收波長的確定

取1 mL 0.4 g/L的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液，與33 μL Wagner試劑混合，定容于25 mL容量瓶，蒸餾水為對照，在240～450 nm掃描，確定DNJ的最大吸收波長[11-12]。

1.2.2 DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0.02 mg/mL的DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液0.16、0.24、0.32、0.40、0.48 mL測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到DNJ質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程：y=0.036 9x-0.031 4，R2=0.992 6。

1.2.3 不同因素對DNJ提取的影響

稱取60目桑葉粉末4 g于三角瓶中，溫度40 ℃、pH 4，按照料液比(g/mL)1∶10，分別加入體積分數(shù)為0、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，確定乙醇體積分數(shù)。

按照乙醇體積分數(shù)50%、溫度40 ℃、pH 4，料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1：14、1∶16，確定料液比。

按照乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶10、溫度40 ℃，pH 3、4、5、6、7、8，確定pH；

按照乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶10、溫度40 ℃，提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃，確定溫度。

分別于120 r/min水浴恒溫振蕩器反應(yīng)30 min，重復(fù)3次，過濾反應(yīng)液，將濾液離心得到上清液，對上清液堿化，活性炭脫色、過濾，將濾液置于蒸發(fā)皿中，50 ℃蒸至恒重，蒸餾水定容至100 mL，測定DNJ質(zhì)量濃度[13]。

1.2.4 正交試驗

通過正交試驗進一步確定DNJ提取的最佳工藝參數(shù)，L9(34)正交試驗方案見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5 DNJ的濃縮純化

將最佳工藝提取的樣液，與石油醚按體積比1∶1 加入250 mL分液漏斗中，多次振蕩后靜置過夜，重復(fù)脫脂3次，下層樣液倒入蒸發(fā)皿中，50 ℃ 恒溫蒸至恒重，得到固形物，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中，進行測定。將石油醚脫脂后的樣液與水飽和正丁醇按1∶1比例加入到250 mL分液漏斗中，多次振蕩后靜置過夜，重復(fù)萃取3次，合并上層樣液后倒入蒸發(fā)皿中，50 ℃恒溫蒸至恒重，得到固形物，蒸餾水定容于100 mL 容量瓶中，測定酶活和DNJ質(zhì)量濃度[14-15]。DNJ質(zhì)量、得率及純度的計算公式[16]為

m=ρnV

得率=m/m0×100%

純度=m/m1×100%

式中：ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出提取液中DNJ的質(zhì)量濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)，V為配成溶液的體積，mL；m0為桑葉質(zhì)量，g；m1為固形物質(zhì)量，g。

1.2.6 蔗糖酶抑制活性檢測

1.2.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得葡萄糖的回歸方程：y=1.109x-0.019，R2=0.995 0。

1.2.6.2 蔗糖酶反應(yīng)速率的測定方法

將用0.2 mol/L pH=4.6的醋酸-酸酸鈉緩沖溶液配制7.5 U/mL的蔗糖酶液、底物蔗糖溶液于35 ℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱10 min。向蔗糖溶液中加入20 μL DNJ，蒸餾水為對照，加20 μL蔗糖酶稀釋液，攪拌反應(yīng)3 min，立即取1 mL反應(yīng)液于100 ℃沸水浴滅活10 min[17]。DNS反應(yīng)體系為300 μL反應(yīng)液與300 μL DNS混合，沸水浴反應(yīng)5 min，加水至4.5 mL，于OD540測定吸光度。

根據(jù)底物蔗糖不同濃度，繪制酶反應(yīng)速率曲線。

1.2.6.3 純化的DNJ對蔗糖酶的抑制作用

底物蔗糖濃度在一定的條件下，以不同質(zhì)量濃度的DNJ溶液與等體積的蔗糖酶溶液混合反應(yīng)，按照“1.2.6.2”方法測定酶反應(yīng)速率。

在35 ℃、pH=4.6條件下，以蔗糖為底物，與對照相比，DNJ每分鐘使蔗糖酶少生成的還原糖的量定義為DNJ的1個抑制單位，μg/(mL·min)。

1.2.6.4 蔗糖酶抑制率計算

抑制率=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

式中：A0為對照組吸光度；A1為試驗組吸光度；A2為背景校正值[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNJ最大吸收波長的確定

DNJ分子結(jié)構(gòu)中缺少吸光基團，在紫外、可見光波段都沒有吸收峰值。將DNJ與Wagner試劑反應(yīng)，生成棕色絡(luò)合物改變了DNJ的吸光特性[19]。如圖1所示，DNJ在284和356 nm處都有吸收峰。在284 nm處峰高而窄，而356 nm處峰低而寬。本研究選取284 nm為DNJ的理想吸收波長。

圖1 DNJ的紫外最佳吸收光譜

2.2 不同單因素對DNJ提取效果的影響

如圖2(a)所示，隨著乙醇體積分數(shù)提高，DNJ得率也相應(yīng)增大。在乙醇體積分數(shù)60%時，DNJ得率達到0.710 mg/g；之后有所下降。

如圖2(b)所示，隨料液比的提高，DNJ得率明顯上升；料液比在1∶10時，DNJ得率達到0.653 mg/g，此后升高不明顯。

如圖2(c)所示，當(dāng)提取液pH較小時，隨著pH升高，DNJ得率也相應(yīng)增高。pH=4時，DNJ得率最高達到0.720 mg/g；之后DNJ得率不斷下降。

如圖2(d)所示，隨著溫度的升高，DNJ得率不斷提高，在70 ℃時，DNJ得率達到0.697 mg/g；超過70 ℃后，DNJ得率開始下降。

(a) 乙醇體積分數(shù)

(b) 料液比

(c) 提取液pH

(d) 反應(yīng)溫度

圖2 不同因素對桑葉DNJ提取效果的影響

Fig.2 Effects of different factors on DNJ yields from mulberry leaves

因此，選定乙醇體積分數(shù)為60%、反應(yīng)pH為4.0、料液比為1∶10、提取溫度為60 ℃。

2.3 正交試驗確定DNJ的最佳提取因素

采用正交分析方法對DNJ提取主要影響因素進行優(yōu)化。由表2可知，各因素對DNJ提取質(zhì)量的影響由大到小的次序是乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取液pH。最終確定提取條件為乙醇體積分數(shù)65%、提取液pH 3.5、料液比1∶11、提取溫度55 ℃，在此條件下，得率為0.687 5 mg/g。

2.4 桑葉DNJ的純化方法

將最佳工藝提取的樣液依次經(jīng)石油醚、正丁醇濃縮純化，結(jié)果見表3。由表3可知，乙醇提取的產(chǎn)物經(jīng)過純化后，雖然得率稍微降低，但正丁醇純化后，DNJ的純度提高了20.4%，抑制率提高了19.4%。DNJ質(zhì)量在石油醚純化后略有增加，可能是因為純化前有少量DNJ吸附到油脂上，純化后被釋放出來。

表2 影響桑葉DNJ提取因素的正交試驗與極差分析

Tab.2 Orthogonal test and range analysis of factors influencing on DNJ yield from mulberry leaves

試驗組φ/%pH料液比θ/℃得率/(mg·g-1)111110．638212220．640313330．651421230．658522310．682623120．642731320．709832130．658933210．709K11．9292．0051．9382．029K21．9821．9802．0071．991K32．0762．0022．0421．967k10．6430．6680．6460．676k20．6610．6600．6690．664k30．6920．6670．6810．656極差0．0490．0080．0350．020

表3 桑葉DNJ的提取和純化

2.5 DNJ的生物特性分析

2.5.1 DNJ對蔗糖酶的抑制作用

試驗組加入4 mg/mL DNJ，在不同的底物質(zhì)量分數(shù)，考察了對照組與試驗組的蔗糖酶活性的變化，結(jié)果見圖3。如圖3所示，對照組還原糖的生成量高于試驗組；對照組、試驗組在底物蔗糖質(zhì)量分數(shù)較低時，還原糖生成量與底物蔗糖質(zhì)量分數(shù)成正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級反應(yīng)；在蔗糖質(zhì)量分數(shù)15%～25%，隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增加，還原糖生成量也增加，反應(yīng)表現(xiàn)為混合級反應(yīng)；在蔗糖質(zhì)量分數(shù)25%時，蔗糖酶反應(yīng)能力達到最大，此后還原糖生成量不再明顯增加。所以，在測定DNJ對蔗糖酶的抑制作用時，底物蔗糖的質(zhì)量分數(shù)應(yīng)高于25%，方可排除提取液中蔗糖的干擾。

圖3 桑葉DNJ對不同底物質(zhì)量分數(shù)的蔗糖酶活性的影響

以1/V為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)作圖。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，可求出對照組和試驗組的Vmax和Km，即酶促反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。

如圖4所示，與對照組的Vmax(1.424×10-4mol/(L·min)) 相比，試驗組的Vmax(7.862×10-4mol/(L·min))降低了一半。Km基本保持不變。根據(jù)雙倒數(shù)法作圖，對照組和試驗組的曲線相交，且交點在X軸上，這些特征均符合非競爭性抑制劑的特點。由此斷定桑葉DNJ對蔗糖酶表現(xiàn)為非競爭性抑制作用，非競爭性抑制的發(fā)生有可能是DNJ與蔗糖酶-蔗糖復(fù)合物結(jié)合，抑制二糖的降解引起的[20]。

圖4 不同底物濃度的蔗糖溶液酶促反應(yīng)速度

2.5.2 濃縮后不同質(zhì)量濃度DNJ對蔗糖酶的抑制作用

從圖5可以看出，在DNJ質(zhì)量濃度相同時，純化后的抑制單位比乙醇提取的抑制單位大，正丁醇純化后的抑制單位高于石油醚純化后的抑制單位。在同一提取條件時，隨著DNJ質(zhì)量濃度增加，抑制單位增大，即DNJ對蔗糖酶的抑制作用增強，抑制率提高了19.4%。

圖5 濃縮后不同質(zhì)量濃度桑葉DNJ對蔗糖酶的抑制作用

Fig.5 The inhibitory effects of concentrated DNJ on sucrase at different concentrations

3 結(jié) 論

采用乙醇浸提法從桑葉中提取脫氧野尻霉素，在284 nm處測得最高吸光度，對DNJ提取質(zhì)量的影響由高到低的次序是乙醇體積分數(shù)、料液比、提取溫度、提取液pH。最佳工藝為乙醇體積分數(shù)65%、pH 3.5、料液比1∶11、溫度55 ℃，最高得率為0.687 5 mg/g。經(jīng)石油醚、正丁醇萃取純化后，DNJ的純度可提高20.4%，抑制率也相應(yīng)地提高了19.4%。增加DNJ濃度對蔗糖酶的抑制作用也增強，DNJ對蔗糖酶的生化反應(yīng)表現(xiàn)為非競爭性抑制。

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