劉子森,張 義,王 川,藺慶偉,閔奮力,周巧紅,劉碧云,賀 鋒,吳振斌 (.中國科學院水生生物研究所,淡水生態(tài)和生物技術國家重點實驗室,湖北 武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 00049)
磷是淡水水體富營養(yǎng)化過程的關鍵性影響因子之一[1-2].水體中磷的來源包括外源輸入和內(nèi)源釋放[3].在外源磷的輸入得到有效控制的情況下,內(nèi)源沉積物作為湖泊營養(yǎng)物質的重要蓄積庫,它不僅是外來污染物的歸宿,同時自身營養(yǎng)鹽的釋放成為上覆水體磷的重要來源[4-5].湖泊沉積物磷的控制技術主要分為異位控制技術和原位控制技術兩大類.異位控制技術中常采用的是具有清污徹底,處理技術較成熟的底泥疏浚技術,但其易對湖泊生態(tài)系統(tǒng)多樣性造成威脅,易對環(huán)境造成二次污染[6-8].原位控制技術包括原位物理覆蓋技術[9-11]、原位化學處理技術[12-14]和原位生物修復技術[15-17].相比于異位控制技術,沉積物磷原位控制技術直接在原地對污染底泥進行處理,可避免底泥再懸浮引起大量磷向水體釋放,減少二次污染,且處理成本較低.
沉水植物能夠通過直接吸收、促進含磷物質的沉降、抑制表層沉積物的再懸浮、改變底泥理化性質,增加沉積物中微生物的量等來降低沉積物磷的釋放[18-20].苦草(Vallisneria spiralis,V.spiralis)是一種多年生無莖沉水植物,廣泛分布于我國淡水湖泊與河流中.目前,已有一些關于V.spiralis對富營養(yǎng)化水體的修復作用的研究[21-23].但沉水植物易受溫度、水質等環(huán)境因素的影響,需結合其它技術以實現(xiàn)對沉積物磷的有效控制.
膨潤土是一種以蒙脫石為主要礦物成分的層狀粘土礦物,在自然界中分布較廣[24-25].膨潤土因其吸附性能高,性能穩(wěn)定且價廉,無二次污染等優(yōu)點而應用廣泛.但未經(jīng)處理的膨潤土因雜質含量較高而影響其吸附性能,因此需要對其進行改性處理[26-27].本研究采用改性膨潤土(MB)作為原位物理化學吸附材料,并將其與沉水植物V.spiralis聯(lián)合應用于杭州西湖沉積物磷處理,首次探討MB與V. spiralis聯(lián)合作用對沉積物各形態(tài)磷的吸附效果,以期實現(xiàn)富營養(yǎng)化湖泊沉積物磷高效脫磷,對充分發(fā)揮粘土礦物和沉水植物協(xié)同作用、有效控制富營養(yǎng)化湖泊內(nèi)源磷污染問題有重要的理論和實際意義.
杭州西湖(120°08′E,30°15′N)位于浙江省杭州市西面,是典型的淺水城市湖泊,湖泊水面面積6.5km2,平均水深為2.27m.西湖的子湖之一小南湖局部湖區(qū)沉積物污染嚴重.用彼得森采泥器(HNM1-2型)現(xiàn)場采集了小南湖湖心(30°23′16′N,120°13′18′E)表層0~10cm的底泥(采樣點水深2.05~2.20m,泥深約0.5m)作為本研究的沉積物樣品.采集的沉積物樣品現(xiàn)場用氧化還原(ORP)去極化法全自動測定儀測定氧化還原電位和pH,當天運回實驗室,并分別對其進行實驗設計:栽種V. spiralis、鋪設不同厚度的MB以及在鋪設了MB的沉積物上栽種V. spiralis.采樣點如圖1所示.
圖1 沉積物采樣點Fig.1 The geographic location of the sampling site
沉積物采集的同時對其上覆水進行相關理化性質分析(經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾,過濾后的上覆水置于冰箱4℃保存?zhèn)溆?,分析結果見表1.
表1 沉積物上覆水的理化性質Table 1 Physical and chemical characters of overlying water above sediments
膨潤土顆粒(3~5mm)采購于山東泗水恭發(fā)有限公司.采用酸改性、鹽改性、高溫焙燒改性及復合改性等多種改性方法對膨潤土原土(RB)顆粒進行改性處理,通過研究不同MB對沉積物總磷的吸附性能,確定最佳改性方法[28].本研究將RB浸入10%的Na2CO3溶液(固液比為1:3),水浴加熱攪拌2h(70℃),用蒸餾水洗至中性,于150℃烘干后置于馬弗爐(450℃)煅燒2h,制得MB.
試驗所用的沉積物和上覆水取自小南湖表層沉積物(0~10cm)和湖水.試驗共設計5個處理組: V. spiralis組、MB組(共3組,分別為厚度1cm MB組、3cm MB組和5cm MB組)、厚度5cm MB+V. spiralis組,每組3平行.直徑45cm、高55cm的聚乙烯桶內(nèi)填充10cm底泥和60cm湖水,有植物的處理組栽種大小形態(tài)相近長約20cm的沉水植物V. spiralis,插入沉積物深度約為4cm.種植時保證生物量一致,每個聚乙烯桶中種植9株V. spiralis.植物種植后需穩(wěn)定5d,5d后即可開始試驗,每間隔一個月采一次樣,測定沉積物中各形態(tài)磷含量.150d后采集沉積物,帶回實驗室于-80℃保存,留作微生物試驗樣品.
使用保存于-80℃的沉積物樣品提取細菌DNA.以Omega E.Z.N.A.TMSoil DNA 試劑盒,依照說明書的步驟進行DNA的提取.將提取后的DNA以正向引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和反向引物907R(5′CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對16S rDNA基因的V4~V5區(qū)進行擴增.PCR過程采用ABI GeneAmp? 9700循環(huán)加熱儀進行.具體的為:20μL混合體系含有10ng DNA模板,250μM dNTPs,上下游引物各0.2μM,0.4μL FastPfu DNA Polymerase,4μL of 5×TransStart? FastPfu Buffer.PCR過程包含27個循環(huán),每個循環(huán)95℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45.對擴增產(chǎn)物進行純化和定量之后,構建DNA文庫.此后,通過Illumina HiSeq 2500platform生成250bp paired-end (PE)的原始序列.
依據(jù)序列標簽將原始序列對應于每個樣品,經(jīng)過數(shù)據(jù)拆分,去引物序列、PE Reads拼接、Tags質量及長度過濾飽和截取以及去嵌合體后,每個樣品獲得的有效序列的平均數(shù)為35.493.對所有樣品的全部有效序列進行97%的一致性(Identity)聚類,形成OUT.使用R軟件進行OUT各個分類等級的注釋比例和各個分類等級物種相對豐度的統(tǒng)計.
采用PICRUSt(http://picrust.github.com)軟件進行微生物群落功能的預測.預測得到的基因家族的豐度以與預期的16S rRNA基因拷貝數(shù)1000進行校正,并生成功能分類圖譜KEGG Orthology(KO).選擇涉及P代謝途徑的KOs以得到每個樣品有關P代謝功能基因的總豐富度.作為構建P代謝功能OUTs的選擇方法,參考網(wǎng)站(http:picrust.Github.jo/picrust/scripts/metagenome_contributions.html1#metagenome-contributions)
1.6.1 沉積物磷形態(tài)的分級提取及磷濃度測定 沉積物各形態(tài)磷的分級提取采用SMT磷分級分離方法[29].該法具有操作簡單,提取獨立,準確性高等優(yōu)點,且各形態(tài)磷的測定值可相互檢驗.該法將沉積物磷形態(tài)分為鐵鋁磷(Fe/Al-P,主要是吸附在沉積物表面的弱吸附態(tài)磷,Al、Fe、Mn氧化物和水化物結合的磷),鈣磷(Ca-P,主要是與Ca結合的磷),無機磷(IP),有機磷(OP)和總磷(TP)5種.沉積物各形態(tài)磷含量的測定采用鉬酸銨分光光度法[30].沉積物磷的去除量計算公式為:q=b-c(1),沉積物磷去除率的計算公式為:a=(b-c)/b× 100%(2).式中:q為沉積物磷的去除量,mg/kg;a為沉積物磷的去除率,%;b和c分別為吸附前和吸附后的沉積物磷含量,mg/kg.
1.6.2 微生物統(tǒng)計分析 針對不同處理組微生物菌門和菌屬的相對豐度,以方差分析判斷配對組之間微生物相對豐度差異的顯著性(P<0.05).配對組兩兩比較的設置如下:MB vs V.spiralis;MB vs V.spiralis.
1.6.3 儀器表征 改性前后膨潤土的元素組成分析采用荷蘭PANalytical.B.V公司X射線光譜儀(XRF,Axios advanced X型);內(nèi)部微觀結構采用日本理學公司的轉靶X射線衍射儀(XRD,RU-200B/D/MAX-RB RU-200B型);表面微觀形貌采用日本電子公司的掃描電子顯微鏡(SEM,JSM-5610LV型).
表2 沉積物基本理化性質Table 2 Properties and chemical compositions of sediment
表3 改性前后膨潤土的化學組成(wt. %)Table 3 The chemical compositions of the bentonite particles before and after modification (wt. %)
圖2 膨潤土原土和改性膨潤土的XRD圖Fig.2 XRD patterns of of RB and MB
沉積物各形態(tài)磷含量及其它物理化學性質如表2所示.由表2可知,沉積物磷主要以IP形態(tài)存在,占TP的80.5%,沉積物磷的活性較高,釋磷風險較大[31].
經(jīng)改性處理后,MB較RB的SiO2,Al2O3,CaO,MgO,TiO2,P2O5含量降低,Na2O含量明顯增加(表3),基本礦物組成未發(fā)生變化,主要礦物成分為蒙脫石、鈉長石、方石英等(圖2),形態(tài)更加粗糙(圖3).
圖3 改性前后膨潤土SEM圖Fig.3 SEM images of RB and MB
試驗過程中V. spiralis對沉積物各形態(tài)磷的去除效果如圖4所示,由圖可以看出:實驗運行30d時,TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P各形態(tài)磷的去除量分別為40.86、25.16、11.99、16.93和6.78mg/kg.隨著運行時間的持續(xù)增加,沉積物各形態(tài)磷的去除量基本上持續(xù)增加,但在60~90d時有輕微回落,TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P在150d時的去除量分別為181.6、148.74、26.32、101.74和44.99mg/kg.在365d時,TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P的去除量分別為241.89、183.21、46.23、128.73和50.03mg/kg,它們的去除率分別為16.97%、15.99%、16.63%、23.07%和8.61%.沉水植物V. spiralis通過根系等的直接吸收或間接影響,降低了間隙水中磷的濃度,減小了與上覆水的濃度差,減緩了沉積物磷釋放的速度,降低了沉積物中的磷含量[32].
圖4 V. spiralis對沉積物各形態(tài)磷的去除效果Fig.4 Removal performance of V. spiralis on sediment P in all fractions
2.3.1 厚度1cm MB +V. spiralis聯(lián)合處理沉積物磷 如圖5所示,0~60d內(nèi),沉積物OP的去除量逐漸增大,之后趨于平穩(wěn);沉積物TP、IP、Fe/Al-P和Ca-P去除量隨著時間的推移而增大.在反應時間為150d時,TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P的去除量分別為431.6、307.4、113.8、200.5和117.8mg/kg;當反應時間為365d時,TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P的去除量分別為557.3、398.1、135.6、267.2和129.7mg/kg,它們的去除率分別為39.2%、34.7%、50.8%、47.9%和22.3%.由此可知,厚度1cm MB和V. spiralis聯(lián)合組對沉積物磷的去除過程隨著作用時間的增加,去除量越來越大,且去除的沉積物磷以OP和Fe/Al-P為主.MB的加入明顯減少了沉積物中的磷含量,本組沉積物TP的去除率是V. spiralis組的2.30倍.2.3.2 厚度3cm MB +V. spiralis聯(lián)合處理沉積物磷 如圖6所示,沉積物各形態(tài)磷的去除量在0~60d內(nèi)先增大,此后增長緩慢.沉積物中的磷在V. spiralis與3cm厚的MB作用下,在反應時間為150d時,TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P的去除量分別為551.2、337.2、210.9、179和151.2mg/kg;在365d它們的去除量分別為671.3、431.5、221.1、221.7和202.9mg/kg,它們的去除率分別為47.2%、37.7%,82.8%、39.7%和35.0%.由此可知,厚度3cm MB+V. spiralis聯(lián)合組對沉積物磷的去除有一定效果,與厚度1cm MB+V. spiralis聯(lián)合組對沉積物磷的去除效果相比,TP、OP、IP、Fe/Al-P、Ca-P各形態(tài)磷的去除量在365d時分別增加了114、33.4、85.5、-45.5、73.2mg/kg,即厚度3cm MB+V. spiralis聯(lián)合組對沉積物TP、OP、IP和Ca-P的去除效果較好,但其對沉積物Fe/Al-P的去除量比厚度1cm MB+V. spiralis聯(lián)合組的去除效果差.
圖5 厚度1cm MB和V. spiralis聯(lián)合對沉積物各形態(tài)磷的去除效果Fig.5 V. spiralis and 1cm MB on sediment P removal
圖6 厚度3cm MB和V. spiralis聯(lián)合對沉積物各形態(tài)磷的去除效果Fig.6 V. spiralis and 3cm MB on sediment P removal
2.3.3 厚度5cm MB+V. spiralis聯(lián)合處理沉積物磷 如圖7所示,沉積物中的磷在V. spiralis與5cm厚的MB的作用下,0~60d內(nèi)沉積物TP的去除量增長趨勢明顯,60d以后,去除量的增長速度緩慢.隨著作用時間的持續(xù),沉積物IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P的去除量逐漸增大.作用時間為150d時,沉積物TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P的去除量分別為615.6、371.4、242.4、236.3和145.7mg/kg;在365d時,它們的去除量分別為851.3、654.2、181、372.3和259.2mg/kg,去除率分別為59.8%、57.1%、67.8%、66.7%和44.7%.厚度5cm MB+V. spiralis聯(lián)合組對沉積物各形態(tài)磷的去除過程中,效果最明顯的磷形態(tài)由強至弱分別為Fe/Al-P>OP>TP>IP>Ca-P,因此本組實驗對Fe/Al-P和OP的去除效果尤為明顯. Fe/Al-P是與沉積物中易發(fā)生氧化還原作用的鐵氧化物或鐵氫氧化物結合的磷.大部分的研究認為這種形式的磷是較易于釋放的,在沉積物中起到指示污染物的作用[33-34].沉水植物V.spiralis在生長的過程中通過發(fā)達的根系能夠大量地吸收利用沉積物中的Fe/Al-P,以滿足自身生長的需要[35-36].這可能是導致Fe/Al-P在植物根系區(qū)域較低的原因之一.
圖7 厚度5cm MB和V. spiralis聯(lián)合對沉積物各形態(tài)磷的去除效果Fig.7 V. spiralis and 5cm MB on sediment P removal
厚度為5cm MB對沉積物各形態(tài)磷的處理效果如圖8所示.在作用時間為365d時,沉積物TP、IP、OP、Fe/Al-P和Ca-P的去除量分別為421.6、260.8、143.9、178.8和78.2mg/kg,去除率分別為29.6%、22.8%、53.9%、66.4%和29.2%.
圖8 厚度5cm MB對沉積物各形態(tài)磷的去除效果Fig.8 Sediment P removal effect by 5cm MB
由圖5~圖8可知,不同厚度的MB對沉積物磷的去除效果不同.作用時間為150d時,厚度5cm MB+V. spiralis對沉積物TP的聯(lián)合去除量較厚度1cm MB+V. spiralis對沉積物TP的聯(lián)合去除量高184mg/kg;365d時高達294mg/kg.由表4可知,厚度5cm MB與沉水植物V. spiralis對沉積物磷的聯(lián)合作用效果優(yōu)于MB和沉水植物V.spiralis單獨作用之和. V. spiralis和MB對沉積物磷的去除過程中,可能存在有益于去除沉積物磷的相互促進作用.分析原因可能為:MB含有某些微量元素,可促進植物生長,從而進一步加強了對沉積物磷的吸收;多孔狀表面粗糙的MB,可附著大量微生物,MB顆粒表面微生物和沉水植物V.spiralis根系微生物同時作用,對沉積物磷進行礦化作用;沉水植物的吸收和礦化作用,使難以吸附的OP等轉化為易被吸附的IP. V. spiralis根系通過提高根系周圍溶解氧,改變沉積物環(huán)境,來影響沉積物中各形態(tài)磷之間的遷移轉化,同時V.spiralis生長過程中吸收利用大量沉積物中的磷,從而導致了沉積物各形態(tài)磷含量的空間差異[37].
表4 3種不同處理方式對沉積物TP的最大去除量(mg/kg)Table 4 The maximum removal amounts of TP in sediment with three technologies (mg/kg)
如圖9所示,配對組微生物相對豐度的方差分析表明,在菌門水平下,相比單一V. spiralis組或單一MB組,聯(lián)合組中厚壁菌門Firmicutes和Spirochaetes豐度更高,而綠灣菌門Chloroflexi 豐度較低.在菌屬水平下,相比單一V.spiralis組或單一MB組,聯(lián)合組中PSB-M-3,HB-118,desulfobacca和Gracilibacter豐度更高.相比單一MB組,分別屬于硝化螺旋菌門和變形菌門的菌屬4-29和Dok59在聯(lián)合組中豐富度更高;然而相比單一V.spiralis組,這兩個屬在聯(lián)合組中豐度較低.分別屬于厚壁菌門和硝化螺旋菌門的Lactococcus和Caldilinea則與4-29和Dok59這兩個菌屬呈現(xiàn)相反的規(guī)律.
圖9 處理組兩兩比較下相對豐度具有顯著性差異(P<0.05)的微生物門和屬Fig.9 Comparison analysis of microorganisms with significant difference (P<0.05) between different treatments (V.spiralis vs MB + V. spiralis; MB vs MB + V. spiralis) on phylum (a and b) and genus (c and d) level
利用PICRUSt進行微生物群落功能預測,得到了涉及P代謝的基因家族的相對豐度.群落中涉及P代謝的總共361個Kos在單一MB組、單一V. spiralis組和聯(lián)合組中的基因豐度分別為9.65%,9.55%和9.59%.如圖10所示,在屬水平上,變形菌門的Anaeromyxobacter和Dechloromonas、厚壁菌門的Lactococcus以及硝化螺旋菌門的4-29和Nitrospira是本研究沉積物微生物群落涉及P代謝功能的主要菌屬.這5個屬合計對沉積物微生物菌落P代謝功能的貢獻率約為50%.屬于厚壁菌門Erysipelotrichaceae科的菌屬PSB-M-3,其在聯(lián)合組中對P代謝的貢獻率為6.26%,而在兩個單一組中貢獻率均低于0.7%.相比單一MB組和聯(lián)合組,菌屬Anaeromyxobacter,Dechloromonas,4-29和Nitrospira在單一V. spiralis組中對P代謝功能的貢獻率更高.相比單一V. spiralis組和聯(lián)合組,厚壁菌門的3個屬Lactococcus,Tepidibacter和Exiguobacterium在單一MB組中對P代謝功能的貢獻率更高.以上分析結果表明,MB和V. spiralis聯(lián)合作用下,厚壁菌門屬PSB-M-3增強了沉積物微生物群落P代謝功能.
Dechloromonas sp.和Nitrospira sp.通常在脫氮除磷的污水處理系統(tǒng)中共存.Dechloromonas[38]曾被報道為聚磷菌出現(xiàn)在氧化溝污水處理廠[39]和續(xù)批式污泥反應中[40].屬于Dechloromonas和Exiguobacterium的某些菌種可以對不同的無機磷源和有機磷源進行溶解或礦化[41-42].以上菌屬對于沉積物磷的積累、溶解和礦化促進了MB和V. spiralis聯(lián)合組對沉積物P的去除.通過增加厚壁菌門Erysipelotrichaceae科菌屬PSB-M-3的豐度,聯(lián)合組相比單一組沉積物微生物群落P代謝的功能得以增強.Erysipelotrichaceae科的微生物通常被報道為與炎癥反應相關[43]以及抗生素耐受的腸道微生物[44],但卻很少在水體生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境中被報道.本研究首次發(fā)現(xiàn)了Erysipelotrichaceae 科微生物可以作為水體沉積物中潛在的除磷菌.
圖10 MB和V. spiralis聯(lián)合作用下沉積物中菌屬對P代謝功能的貢獻率Fig.10 Contributions of each genus that related to P metabolism function estimated by PICRUSt
MB富含多種礦物元素,可以促進沉水植物V. spiralis生長.此外,植物為了應對P的缺乏,可能通過根系分泌作用直接促進溶磷或是通過促進根際微生物群落的P代謝活性間接地增加沉積物中的生物可利用性P含量.張亞朋等[45]研究表明, 苦草對沉積物微生物群落結構有一定影響,沉水植物的生長可以增加沉積物中革蘭氏陽性菌的百分含量,同時降低革蘭氏陰性菌的百分含量,改變其微生物群落組成及生態(tài)學功能,對其進行相關性分析發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌與總磷、無機磷呈顯著負相關,而革蘭氏陰性菌與有機磷、無機磷呈顯著正相關,磷可能是影響沉積物中微生物活性及群落結構的限制性營養(yǎng)因素.由表5可得,隨著時間的推移, V. spiralis的生物量逐漸增大,且V. spiralis + MB聯(lián)合處理組的生物量高于V. spiralis處理組.
表5 V. spiralis在0d,150d和365d的生物量(g/m2)Table 5 The V. spiralis biomasses on 0d,150d and 365d (g/m2)
3.1 MB與沉水植物V.spiralis對沉積物磷的聯(lián)合作用效果好,聯(lián)合作用優(yōu)于MB和沉水植物V.spiralis單獨作用之和.
3.2 MB可以促進沉水植物V. spiralis的生長, V.spiralis可能通過根系分泌作用促進溶磷或是通過促進根際微生物群落的P代謝活性間接地增加沉積物中的生物可利用性P的含量.厚壁菌門Erysipelotrichaceae科的菌屬PSB-M-3是聯(lián)合組相比單一V. spiralis組或單一MB組沉積物微生物群落P代謝功能增強的主要貢獻者.
3.3 MB和沉水植物聯(lián)合控制沉積物磷技術可進一步應用到富營養(yǎng)化湖泊沉積物控制工程.
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致謝:感謝“十二五”水專項西湖工作站的老師和同學們對本研究的指導和幫助.