ABR-MBR組合工藝短程硝化過程的微生物種群

趙詩惠,呂 亮,蔣志云,吳憶寧,吳 鵬,3,沈耀良,3* (1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009；2.江蘇省水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 蘇州 215009；3.江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 蘇州 215009)

目前,廢水生物處理中的短程硝化是污水處理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-2],而微生物在系統(tǒng)中的種群特征研究有待進(jìn)一步深入開展.已有的研究表明,在污水處理系統(tǒng)活性污泥中AOB是占主導(dǎo)地位的優(yōu)勢(shì)菌群[3-4],可通過控制水力停留時(shí)間[5-6]、溶解氧[7-8]、pH值[9]、溫度[10-11]等因素使AOB大量富集以實(shí)現(xiàn)短程硝化[12].微生態(tài)系統(tǒng)的特征直接影響廢水處理的效果,因此,分析和研究微生物的特性十分重要,這不僅對(duì)短程硝化工藝的優(yōu)化和控制提供依據(jù),也為開發(fā)新型短程硝化工藝具有很重要作用.

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以較精確的分析微生物多樣性,且廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)、功能菌分布特征等方面[13-14],如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、高通量測(cè)序和克隆測(cè)序等方法[15-19].高通量測(cè)序技術(shù)作為新一代微生物種群鑒定技術(shù),具有分析結(jié)果準(zhǔn)確、高效和高靈敏度等特點(diǎn),在環(huán)境微生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛.本研究采用Miseq高通量測(cè)序手段對(duì)ABR-MBR組合工藝短程硝化過程中微生物種群豐度、多樣性及優(yōu)勢(shì)菌群分布特征進(jìn)行分析,以期為短程硝化過程提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

圖1 ABR-MBR組合工藝實(shí)驗(yàn)裝置Fig.1 Schematic diagram of ABR-MBR setup

采用的ABR-MBR組合工藝試驗(yàn)裝置如圖1所示.該裝置由4個(gè)隔室的ABR反應(yīng)器和MBR好氧池耦合而成,均采用有機(jī)玻璃制成.ABR反應(yīng)器和MBR好氧池的有效容積分別為7.2L和3.6L,MBR好氧池底部采用微孔曝氣裝置.

1.2 試驗(yàn)水質(zhì)和接種污泥

試驗(yàn)用水為低C/N模擬生活污水,詳見表1.反應(yīng)器的接種污泥取自蘇州市某城市污水處理廠,為全程硝化污泥,硝化性能良好.ABR和MBR反應(yīng)器接種污泥MLSS分別約為28000mg/L和4000mg/L.

表1 ABR-MBR組合工藝進(jìn)水水質(zhì)Table 1 Characteristics of the influent wastewater in ABR-MBR process

1.3 ABR-MBR組合工藝的運(yùn)行

本研究的ABR-MBR反應(yīng)器運(yùn)行數(shù)據(jù)取自第41d～179d,根據(jù)運(yùn)行參數(shù)將試驗(yàn)分為9個(gè)階段(Ⅰ～Ⅸ)如表2所示.研究過程中,通過水浴加熱控制溫度為28～32℃、pH值為7.1～7.4、保持MBR溶解氧濃度為0.5～1mg/L.

表2 ABR-MBR組合工藝試驗(yàn)方案及運(yùn)行參數(shù)Table 2 Experimental schemes and parameter of ABR-MBR processes

1.4 水質(zhì)指標(biāo)的檢測(cè)和方法

反應(yīng)器運(yùn)行期間,定期采集水樣經(jīng)0.45μm中性濾紙過濾后,按照國家環(huán)保部規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法《水質(zhì)和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》[20]對(duì)COD、氨氮()、硝酸鹽氮()、亞硝酸鹽氮()和磷酸鹽()指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定分析.其中COD采用快速消解法,采用納氏試劑光度法,N采用紫外分光光度法,采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法,采用鉬銻抗分光光度法.為方便數(shù)據(jù)分析,定義亞硝酸鹽積累率(NAR)如式(1):

1.5 微生物多樣性的檢測(cè)和方法

樣品采集:為研究短程硝化系統(tǒng)中的微生物種群,在MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.32、0.50、0.94kg/(m3·d)且穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)期,于MBR中部進(jìn)行取樣,污泥樣品對(duì)應(yīng)編號(hào)為M1、M2和M3.

總DNA的提取與PCR擴(kuò)增:采用FastPrep DNA提取試劑盒法(QBIOGENE,USA)DNA,完成基因組DNA抽提,并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA.PCR擴(kuò)增測(cè)序區(qū)域?yàn)?38F_806R,擴(kuò)增引物采用16S RNA基因V3～V4區(qū)通用引物(338F/806R).引物名稱和引物序列分別是338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACT ACHVGGGTWTCTAAT).PCR正式試驗(yàn)采用TransGen AP 221-02:TransStartFastpfu DNA Polymerase,20μL反應(yīng)體系.全部樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行,每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù),將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris_HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測(cè).參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor? -ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量,之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合.

Miseq文庫構(gòu)建與測(cè)序:1) Miseq文庫構(gòu)建:通過PCR將Illumina官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端并回收PCR產(chǎn)物;Tris-HCl緩沖液洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測(cè);氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段.2)Miseq測(cè)序:按照高通量測(cè)序平臺(tái)的操作說明對(duì)形成的cDNA文庫進(jìn)行Miseq高通量測(cè)序,將測(cè)序得到的DNA序列進(jìn)行拼接,同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制,對(duì)區(qū)分樣品后得到的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(OUT)分類.并利用i-sanger生信分析云平臺(tái)對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行在線處理和分析.

生物多樣性和分類學(xué)分析:將序列按照彼此的相似性歸為操作分類單元(OTU),按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類,在聚類過程中去除嵌合體,得到OTU的代表序列.為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息,采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,分別在各個(gè)分類水平:domain(域)、kingdom(界)、phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)和species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成.通過單樣本的多樣性(Alpha多樣性)分析反映微生物群落的豐度和多樣性,如Chao指數(shù)、ACE指數(shù)可以反映群落豐富度;shannon指數(shù)、simpson指數(shù)和coverage指數(shù)可以反映群落多樣性.

2 結(jié)果與討論

2.1 ABR-MBR反應(yīng)器運(yùn)行狀況分析

由圖2可見,在Ⅰ～Ⅶ階段,隨著MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷的提高,ABR-MBR反應(yīng)器中平均出水由24.1mg/L降為4.6mg/L,平均出水由2.5mg/L升至8.2mg/L,同時(shí)亞硝酸鹽積累率整體呈上升趨勢(shì),逐步向短程硝化轉(zhuǎn)變.在MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.21～0.32kg/(m3·d)時(shí)(Ⅰ～Ⅲ),亞硝酸鹽積累率維持在10%～20%;縮短ABR水力停留時(shí)間,從而提高M(jìn)BR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.36～0.50kg/(m3·d)(Ⅳ～Ⅵ),此時(shí)亞硝酸鹽積累率上升并接近40%;繼續(xù)縮短ABR水力停留時(shí)間為6h,MBR水力停留時(shí)間為3h,此時(shí)氨氮負(fù)荷為0.94kg/(m3·d),亞硝酸鹽積累率進(jìn)一步提高到60%以上,同時(shí)氨氮去除率穩(wěn)定在90%以上,即MBR實(shí)現(xiàn)了短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.繼而通過調(diào)控MBR池中液位高度增加MBR水力停留時(shí)間為4h和5h(Ⅷ、Ⅸ),進(jìn)水氨氮負(fù)荷隨之降低,亞硝酸鹽積累率降低到40%甚至一度低于20%以下.由于較低的氨氮負(fù)荷使NOB的活性抑制減小,使較多的轉(zhuǎn)化為,導(dǎo)致亞硝酸鹽積累率降低[21],從另一個(gè)角度也說明短程硝化過程受環(huán)境影響較大.侯愛月等[22]對(duì)模擬無機(jī)城市污水采用SBR反應(yīng)器控制溫度在20～22℃,pH值在7.2～7.9,溶解氧在0.5～1mg/L,運(yùn)行至第80個(gè)周期,NAR達(dá)到90%,實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的短程硝化.本研究中,控制溫度為28～32℃、pH值為7.1～7.4、采用低溶解氧濃度(0.5～1mg/L)的運(yùn)行條件,逐步提高M(jìn)BR氨氮進(jìn)水負(fù)荷是ABR-MBR組合工藝實(shí)現(xiàn)短程硝化的主要原因.

圖2 不同MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷下、和NAR的變化Fig.2 Variations of 、 and NAR at different influent ALR

2.2 Miseq高通量測(cè)序結(jié)果分析

2.2.1 微生物種群多樣性分析 利用Miseq平臺(tái)對(duì)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷分別為0.32、0.50、0.94kg/(m3·d)時(shí)的3個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序,分別獲得40201、38167、39827條優(yōu)化序列,將優(yōu)化序列在97%的相似性下進(jìn)行聚類,分別獲得409、512、588個(gè)OTU數(shù)(如表3).并且3個(gè)樣品的Coverage(物種覆蓋度)均大于99%,表明本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況.

表3 MBR池微生物種群豐度和多樣性分析Table 3 Species abundance and diversity of microbial communities in the MBR

ACE指數(shù)和Chao指數(shù)是用來估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù),反映微生物種群的豐富度,值越高表明微生物種群豐富度越高;Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是用來估算樣本中微生物多樣性的指數(shù),Shannon值越大,說明微生物種群多樣性越高,Simpson指數(shù)值越大,說明微生物種群多樣性越低,同時(shí)也說明優(yōu)勢(shì)微生物占總生物量的比例越大.

表3顯示,3個(gè)污泥樣品的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均為M2＞M3＞M1,結(jié)果表明,當(dāng)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.50kg/(m3·d)時(shí),系統(tǒng)中微生物種群的豐富度和多樣性均高于其他兩種情況.該條件提供給大量微生物適宜生長(zhǎng)的環(huán)境和基質(zhì),使大量微生物共存.此外,3個(gè)樣品的豐富度指數(shù)波動(dòng)變化較小,表明氨氮負(fù)荷對(duì)MBR池微生物種群的豐富度影響較小.另一方面,3個(gè)污泥樣品的Simpson指數(shù)為M3＞M2＞M1,結(jié)果表明,隨氨氮負(fù)荷升高,系統(tǒng)中優(yōu)勢(shì)微生物占總生物量比重逐漸增大,即優(yōu)勢(shì)微生物愈來愈明顯.當(dāng)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷為0.940kg/(m3·d)時(shí)(污泥樣品為M3),MBR池中微生物種群多樣性呈較低水平,優(yōu)勢(shì)微生物種群比例較大且明顯.由于較高的氨氮進(jìn)水負(fù)荷為微生物提供較充足的基質(zhì)濃度,使Nitrosomonas菌逐漸富集, Nitrosomona菌可有效地將轉(zhuǎn)化為,同時(shí)亞硝酸鹽積累率穩(wěn)定在60%以上,但較低的氨氮負(fù)荷下優(yōu)勢(shì)微生物種群不明顯.因此,在不同氨氮負(fù)荷條件下,微生物種群的豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)均較高,使系統(tǒng)微生物結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定,保證了ABR-MBR組合工藝的穩(wěn)定運(yùn)行.

2.2.2 門水平優(yōu)勢(shì)微生物種群分析 圖3給出了污泥樣品在門水平微生物種群組成,表明其具有較高的多樣性,且存在7～8個(gè)門.主要包括變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、綠菌門(Chlorobi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等,并以變形菌門和擬桿菌門微生物為主,二者的相對(duì)豐度比例約占73%～85%.除此之外,厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)是M2和M3特有的菌群.

圖3 微生物種群分類(門)的群落組成相對(duì)百分比Fig.3 Precent of microbial communities on phylun level

從中可知,變形菌門為3個(gè)污泥樣品中占比最大的菌群,豐度分別為60.04%、41.04%和67.77%,結(jié)果表明,變形菌門在系統(tǒng)中為優(yōu)勢(shì)菌群,這一結(jié)果與侯愛月等的研究結(jié)果一致即變形菌門所占比例最大為35%.國內(nèi)外研究表明,大多數(shù)在生物脫氮及諸多污染物降解過程中起重要作用的微生物均歸屬于變形菌門[23-24].因此,測(cè)試結(jié)果也說明MBR池中的污泥具有較好的生物脫氮及去除污染物的能力.其次為擬桿菌門,在3個(gè)樣品中的豐度比例分別為19.67%、26.12%和16.53%.其常存在于城市或工業(yè)污水處理廠的活性污泥中,是一種特殊的細(xì)菌,包括糖的降解,并可能參與多糖和肽的轉(zhuǎn)化[25].厚壁菌門存在于M2和M3樣品中,所占比例為5.84%和1.60%,其主要以芽孢桿菌為主,另外含有少量的微桿菌和葡萄球菌,值得一提的是,芽孢桿菌具有促硝化作用,能夠降解廢水中的氨氮,因此具有較好的污水凈化能力[26].除此之外,硝化螺菌屬(Nitrospira)所在的硝化螺旋菌門在各個(gè)樣品中所占比例較小,而Nitrospira是絕大多數(shù)文獻(xiàn)中報(bào)道的在生物脫氮過程中占主導(dǎo)地位的亞硝酸鹽氧化菌(NOB)[27-28].

為進(jìn)一步探索脫氮微生物所在的變形菌門在不同MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷下微生物的分布特征,現(xiàn)對(duì)MBR池中變形菌門在綱分類水平的分布特征進(jìn)行分析,結(jié)果見表4.從中可知,3個(gè)樣品中β-變形菌綱(Bataproteobacteria)是變形菌門豐度最大的菌群,其占細(xì)菌總量的比例分別為51.64%、62.73%和57.05%.另外,β-變形菌綱中存在的部分反硝化細(xì)菌和亞硝化細(xì)菌在脫氮及污染物去除中起著重要作用[29].其次為γ-變形菌綱(Gamaproteobacteria),占比為26.53%、18.86%和18.24%,而δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)占比最低.

表4 MBR池中變形菌門微生物的群落組成相對(duì)百分比(%)Table 4 Precent of microbial communities on Proteobacteria in the MBR on class levle (%)

2.2.3 屬水平優(yōu)勢(shì)微生物種群分析 為進(jìn)一步闡明系統(tǒng)在運(yùn)行過程中微生物種群的變化情況,在屬的水平上對(duì)3個(gè)樣品的功能微生物及優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分析.

如圖4所示,在屬分類水平上,3個(gè)樣品中主要屬類為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、硝化螺菌屬(Nitrospira)、甲基球菌屬(Methyloparacoccus)和Denitratisoma.其功能微生物為脫氮微生物,主要包括亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),硝化螺菌屬(Nitrospira)和Denitratisoma,還包括屬于β-變形菌綱的陶厄氏菌屬(Thauera)和硫桿菌屬(Thiobacillus)等反硝化菌.由于MBR池內(nèi)COD較低,同時(shí)存在充足的和,且存在曝氣不完全的缺氧微環(huán)境,為自養(yǎng)反硝化菌提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境.

圖4 微生物種群分類(屬)的群落組成相對(duì)百分比Fig.4 Precent of microbial communities on genus leve

該短程硝化系統(tǒng)中,存在亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),無亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),可以推斷AOB為Nitrosomonas,占總生物量的比例為4.62%～22.56%,且為優(yōu)勢(shì)菌種,而NOB為硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的硝化螺菌屬(Nitrospira),所占比例為0.06%～2.12%.另外,侯愛月等人的研究結(jié)果中AOB所占比例為22.5%,NOB僅為3.75%,證實(shí)了AOB的大量富集有利于短程硝化的實(shí)現(xiàn).這一結(jié)果與多數(shù)污水處理系統(tǒng)中占優(yōu)勢(shì)的AOB為Nitrosomonas,NOB所占比例較小的研究結(jié)果相吻合[30].系統(tǒng)中Denitratisoma具有反硝化性能,占總生物量的1.13%～5.27%.此時(shí),ABRMBR組合工藝的出水氨氮濃度低于2mg/L.因此,功能微生物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性保證了底物有效降解,同時(shí)為系統(tǒng)的處理效果提供了保證.

亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和硝化螺菌屬(Nitrospira)是脫氮系統(tǒng)中常見的亞硝化和硝化細(xì)菌.圖5給出了AOB和NOB的分布特征,在不同MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷下,其占總細(xì)菌的分布比例不同,當(dāng)氨氮負(fù)荷由0.21kg/(m3·d)的增加至0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas和Nitrospira占總生物量比例都在逐漸增加,相對(duì)來說,Nitrosomonas的增加幅度較大,而Nitrospira的增加幅度較小且以較低的豐度水平存在于系統(tǒng)中.在氨氮負(fù)荷為0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas占總生物量比例達(dá)到22.56%,Nitrospira占2.12%.此時(shí),亞硝酸鹽積累率達(dá)到60%以上,氨氮去除率穩(wěn)定在90%以上,結(jié)果表明短程硝化的實(shí)現(xiàn)來自于AOB的大量富集,而NOB的小幅度增長(zhǎng)不會(huì)影響短程硝化的實(shí)現(xiàn).

圖5 AOB和NOB分布特征Fig.5 Distribution characteristics of AOB and NOB

3 結(jié)論

3.1 在ABR-MBR組合工藝中,控制溫度為28～32℃、pH值為7.1～7.4、DO為0.5～1mg/L,逐步提高M(jìn)BR氨氮進(jìn)水負(fù)荷,可促進(jìn)AOB菌群大量富集,實(shí)現(xiàn)短程硝化的穩(wěn)定運(yùn)行.在氨氮負(fù)荷為0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas的相對(duì)豐度為22.56%,亞硝酸鹽積累率穩(wěn)定在60%以上.

3.2 該短程硝化系統(tǒng)中,AOB為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas),無亞硝化螺菌屬(Nitrosospira),Nitrosomonas一直存在于MBR好氧池中并逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種,而NOB為硝化螺菌屬(Nitrospira).當(dāng)MBR氨氮進(jìn)水負(fù)荷由0.21kg/(m3·d)升至0.94kg/(m3·d)時(shí),Nitrosomonas占總細(xì)菌比例由4.97%升高至22.56%,而Nitrospira占總細(xì)菌比例一直保持較低水平,僅為0.06%～2.12%.

3.3 ABR-MBR組合工藝中,亞硝酸鹽積累率與AOB的活性、相對(duì)豐度密切相關(guān).AOB的大量富集有利于短程硝化的實(shí)現(xiàn),NOB的小幅度增長(zhǎng)不會(huì)影響短程硝化的實(shí)現(xiàn).

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