多花黃精實(shí)生苗組培快繁技術(shù)研究

饒寶蓉，謝東奇，陳泳和，周先治，鄒榮春，陳敏建，劉忠輝

0 引言

多花黃精（Polygonatum cyrtonema）屬百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）的多年生草本植物。多花黃精具有養(yǎng)陰補(bǔ)氣、潤肺、益腎、健脾等功效，常用于脾胃虛弱、體倦乏力、口干食少、肺虛燥咳、精血不足、內(nèi)熱消渴［1］。目前，多花黃精的繁殖方式主要是種子繁殖［2－3］和根狀莖繁殖［1］。 但這兩種方法繁殖速度慢，大大限制了多花黃精的種植面積。因此，多花黃精種苗的問題成為了人工大面積種植的瓶頸?，F(xiàn)有的多花黃精栽培基地也迫切需要對多花黃精品種進(jìn)行提純復(fù)壯，以培育出高產(chǎn)的、抗病脫毒的種苗［4］。由此，對多花黃精組培快繁技術(shù)的研究迫在眉睫。

目前有關(guān)多花黃精組織培養(yǎng)的研究剛剛起步，成果較少，對規(guī)?；a(chǎn)尚不足以起到指導(dǎo)作用，因此，我們開展了多花黃精實(shí)生苗組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究，以期初步建立高效、適宜、成熟的多花黃精實(shí)生苗快繁培養(yǎng)體系，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的栽培技術(shù)來滿足市場對多花黃精不斷增長的需求，為工廠化、規(guī)?；亩嗷S精育苗提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用多花黃精種子取自南平市光澤縣承天藥業(yè)多花黃精規(guī)范化生產(chǎn)基地，于2015～2017年在南平市華科生物科技有限公司與南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的獲得

1.2.1.1 種子的預(yù)處理試驗(yàn) 從多花黃精規(guī)范化生產(chǎn)基地取得的多花黃精種子，分別進(jìn)行4種預(yù)處理，L1：種子種皮處理（用沙子磨去），后變溫浸種（將黃精種子浸在1000 mg／kg GA3中，先放置在25℃恒溫催芽箱內(nèi)浸種24 h后，再放置于0～4℃冷藏箱內(nèi)浸種 24 h）；L2：種子種皮不處理，直接變溫浸種；L3：種子種皮處理，未浸種，直接從冷庫中取出；L4：種子種皮不處理，未浸種，直接從冷庫中取出。將處理好的種子無菌播種到培養(yǎng)基中，每瓶10粒，各個(gè)處理10瓶，放到25℃培養(yǎng)室中，觀察其發(fā)芽率。

1.2.1.2 滅菌方式的確定 選擇最佳的種子預(yù)處理方式對種子進(jìn)行處理，用流水沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒30 s，然后用無菌水沖洗3次，放在無菌瓶中用2%NaClO滅菌，時(shí)間分別為0、7、15 min；用無菌水沖洗3次，再用0.1% 的 HgCl2消毒7、14、21 min后，用無菌水沖洗6次，用濾紙吸干外表水分，放入無菌盤子上，將種子播在無菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基表面。每瓶3粒，各個(gè)處理接種50瓶，50粒一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，約10 d后，觀察種子的感染情況，并繼續(xù)觀察發(fā)芽情況。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)條件 均以包含30多種元素的MS為基本培養(yǎng)基，再根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模ㄕT導(dǎo)、增殖、生根）添加不同濃度的6－BA（6－芐基腺嘌呤）、GA3（赤霉素）、2，4－D［5］（2，4－二氯苯氧乙酸）和 NAA［6－7］（萘乙酸）等激素，附加蔗糖 25 g／L（生根培養(yǎng)基20 g／L）、卡拉膠7 g／L，最后調(diào)節(jié)pH 值至5.8（用 1 mol／L NaOH 或 1 mol／L HC1 調(diào)節(jié) pH 值）。 罐裝于培養(yǎng)瓶后，進(jìn)行滅菌，滅菌條件為：121℃、131 kPa，滅菌20 min。培養(yǎng)基制備好之后，置于無菌操作室中，放置72 h，并將紫外燈打開將無菌操作室進(jìn)行滅菌。材料接種后，在光照度1500～2500 lx光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間 11 h／d，培養(yǎng)室溫度保持在（25±1）℃。

1.2.3 黃精種子誘導(dǎo)、芽增殖與生根培養(yǎng)基的激素濃度篩選方法 選擇最佳的種子預(yù)處理方式對種子進(jìn)行處理，后選擇最佳的消毒滅菌方法，將消毒好的種子放入不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶6粒，每個(gè)處理接種30瓶，60粒為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，60 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)結(jié)果。選取生長健壯、大小一致、沒有污染的多花黃精小芽種球切塊成0.3～0.5 cm大小，轉(zhuǎn)移到不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中，每瓶6個(gè)芽，每個(gè)處理接種30瓶，60個(gè)芽為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)增殖情況。選取生長健壯、大小一致、沒有污染的多花黃精小芽，轉(zhuǎn)移到不同激素組合的生根培養(yǎng)基中，每瓶6個(gè)芽，每個(gè)處理接種30瓶，60個(gè)芽為一個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.2.4 煉苗移栽 將較好的多花黃精生根瓶苗移入大棚溫室中培養(yǎng)5 d，打開瓶蓋煉苗3 d后，從瓶中取出試管苗，洗去根部培養(yǎng)基，選擇帶有3條以上根的健康小苗，移栽到基質(zhì)（泥炭土∶沙子＝2∶1）中，每周澆一次營養(yǎng)液，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方式對種子發(fā)芽率的影響

經(jīng)不同方式預(yù)處理后，種子發(fā)芽時(shí)間及發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。由表1可知，不同預(yù)處理方法對種子的發(fā)芽有一定的影響，L3、L4明顯比L1、L2發(fā)芽時(shí)間早、發(fā)芽率高，長勢也明顯優(yōu)于進(jìn)行變溫處理的種子；同是直接從冷庫中取出的種子，L3較L4發(fā)芽時(shí)間早、發(fā)芽率高。從葉片長勢上看，種皮未經(jīng)沙磨處理的略好，可能是由于沙磨處理對種皮造成一定損傷，對后期發(fā)芽生長產(chǎn)生了一定的影響。綜合發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽率及芽生長狀況，將黃精種子直接從冷庫中取出后磨去種皮（L3處理）是發(fā)芽率較高并能縮短發(fā)芽時(shí)間的種子預(yù)處理方式。

表1 不同種子預(yù)處理方式對發(fā)芽率的影響

2.2 不同的滅菌方式對種子污染率與發(fā)芽率的影響

從表2可以看出，兩種滅菌劑（NaClO與HgCl2）的使用以及滅菌時(shí)間的差異，對種子的污染率及發(fā)芽率都有一定的影響。其中，單獨(dú)使用HgCl2（A1～A3）的效果沒有HgCl2與NaClO結(jié)合使用（A4～A9）的效果好；當(dāng) 2%NaClO滅菌時(shí)間相同時(shí)，隨著 0.1%HgCl2滅菌時(shí)間增長，污染率呈現(xiàn)越來越低的趨勢；當(dāng)0.1%HgCl2滅菌時(shí)間相同時(shí)，隨著2%NaClO滅菌時(shí)間增長，污染率呈現(xiàn)越來越低的趨勢；當(dāng)2%NaClO滅菌時(shí)間相同時(shí)，隨著0.1%HgCl2滅菌時(shí)間增長，種子的發(fā)芽率卻出現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當(dāng)0.1%HgCl2滅菌時(shí)間相同時(shí)，隨著2%NaClO滅菌時(shí)間增長，種子的發(fā)芽率卻出現(xiàn)升高的趨勢，即種子的發(fā)芽率隨著0.1%HgCl2滅菌時(shí)間的加長而先升高后降低，說明HgCl2滅菌時(shí)間過長對種子的發(fā)芽有一定的影響，會(huì)對種子的胚產(chǎn)生一定的破壞；但隨著2%Na-ClO滅菌時(shí)間增長，種子的發(fā)芽率出現(xiàn)升高的趨勢。因此，最適的滅菌方式是A8（2%NaClO 15 min＋0.1%HgCl214 min），污染率低且發(fā)芽率高。

表2 不同的滅菌方式對種子污染率與發(fā)芽率的影響

2.3 不同激素配比的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基對黃精不定芽誘導(dǎo)的影響

試驗(yàn)中獲得的無菌苗及初生成的球莖接種于芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后，芽分化結(jié)果如表3。從表3可知，B1、B2處理的發(fā)芽率較低；誘導(dǎo)出的芽長得最好的是B3配方的培養(yǎng)基（MS＋6－BA 1 mg／L＋GA30.2 mg／L），誘導(dǎo)率達(dá) 80%以上；B5配方的培養(yǎng)基雖然芽的數(shù)量較多，誘導(dǎo)率較高，球莖較大，但是球莖出現(xiàn)異形。因此，從6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方中選出較好的 4種配方（B3、B4、B5、B6）對其進(jìn)行增殖效果的比較。

表3 不同激素配比的芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基對不定芽誘導(dǎo)的影響

2.4 不同激素配比的增殖培養(yǎng)基對黃精苗長勢的影響

如表4 所示，B3配方（MS＋6－BA 1 mg／L＋GA30.2 mg／L＋2，4－D 0 mg／L＋ NAA 0 mg／L）的苗長勢不錯(cuò)，葉子大且鮮綠，球莖大，增殖率較高，增殖系數(shù)3.15（以種球上的芽為單位，即增殖系數(shù)＝出芽數(shù)／原有芽數(shù)）；B4配方的葉子長勢不錯(cuò)，但是無種球，增殖率一般，增殖系數(shù)為1.8；B5配方組培苗球莖異常大，葉子少，球莖有點(diǎn)畸形；在B6配方上長得較差，只有零星幾片葉子，出芽率低，增殖系數(shù)低。

表4 不同激素配比的增殖培養(yǎng)基對黃精苗長勢的影響

2.5 不同激素配比的生根培養(yǎng)基對黃精組培苗生根 的影響

從表5可知，6－BA對生根有抑制的作用，當(dāng)6－BA濃度達(dá)0.3 mg／L時(shí)明顯抑制了根的生長，其后生根率為0，但是其對葉子和球莖的生長有明顯的促進(jìn)作用；而NAA對生根有較好的促進(jìn)作用，濃度較低時(shí)更利于生根，高濃度時(shí)也會(huì)出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象。綜合13 種配方的培養(yǎng)效果，H1配方（MS＋6－BA 0 mg／L＋NAA 0.3 mg／L）較為理想，生根率達(dá) 85%，球莖大小中等，葉子長勢較好。但在該配方培養(yǎng)過程中仍然有少數(shù)葉子發(fā)黃，因此后期還要繼續(xù)深入試驗(yàn)，找到一個(gè)葉子既不發(fā)黃，又有利于生根的平衡點(diǎn)。

表5 不同激素配比的生根培養(yǎng)基對黃精組培苗生根的影響

2.6 移栽煉苗

移栽200株健康小苗，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)，存活株為183株，存活率達(dá)到90%以上（圖1～圖2）。

圖1 準(zhǔn)備移栽的小苗

圖2 移栽后的苗

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明：種子發(fā)芽的最佳預(yù)處理方式是將黃精種子直接從冷庫中取出，經(jīng)種皮磨去處理，可提高發(fā)芽率，縮短發(fā)芽時(shí)間；最適的消毒滅菌處理方式是用2%NaClO消毒15 min，再用0.1%HgCl2消毒14 min，污染率較低，發(fā)芽率高，效果最好；誘導(dǎo)及增殖的最適宜培養(yǎng)基是一致的，即MS＋6－BA 1.0 mg／L＋GA30.2 mg／L，其誘導(dǎo)出的芽、葉片長勢良好，葉片大且鮮綠，球莖大，增殖率較高，增殖系數(shù)達(dá)到3以上；理想的生根培養(yǎng)基為MS＋NAA 0.3 mg／L，生根率高達(dá)85%，葉子長勢較好，黃色葉子較少，球莖大小中等。還需進(jìn)一步研究黃精組培苗的落地和栽培試驗(yàn)，對于黃精組培苗能否應(yīng)用于生產(chǎn)，將在后續(xù)的試驗(yàn)中作進(jìn)一步探討。

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