共聚焦激光掃描顯微系統(tǒng)光學(xué)設(shè)計(jì)

肖海東 吳永前

文章編號(hào)： 1005-5630（2018）06-0065-10

摘要： 為了實(shí)現(xiàn)非接觸式、快速高精度的光學(xué)檢測(cè)，設(shè)計(jì)了一種共聚焦激光掃描顯微光學(xué)系統(tǒng)。在保證設(shè)計(jì)指標(biāo)的前提下，簡(jiǎn)化了各光組的結(jié)構(gòu)，采用7片球面透鏡并以K9玻璃作為透鏡材料。使用Zemax軟件對(duì)光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行了設(shè)計(jì)和仿真。結(jié)果表明：物鏡的數(shù)值孔徑為0.49;系統(tǒng)的徑向和軸向光學(xué)分辨率分別為0.400 μm和0.772 μm;顯微聚焦系統(tǒng)聚焦彌散斑直徑小于2 μm;照明系統(tǒng)聚焦彌散斑直徑小于10 μm;探測(cè)系統(tǒng)的聚焦光斑直徑小于20 μm;根據(jù)仿真結(jié)果確定了針孔1和針孔2的尺寸均為20 μm，且厚度不超過(guò)0.1 mm;各子系統(tǒng)的MTF曲線均接近衍射極限，具有很高的光學(xué)傳輸效率。

關(guān)鍵詞： 光學(xué)設(shè)計(jì); Zemax; 激光共聚焦; 顯微物鏡; 照明系統(tǒng); 探測(cè)系統(tǒng)

中圖分類號(hào)： O 439; TH 742文獻(xiàn)標(biāo)志碼： Adoi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2018.06.011

引言

與普通光學(xué)顯微鏡不同，共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）以激光為照明光源，通過(guò)獨(dú)特的針孔濾波技術(shù)和共軛成像原理，抑制了顯微物鏡焦點(diǎn)之外的物點(diǎn)信息的光信號(hào)，進(jìn)而提高了光學(xué)分辨率，同時(shí)采用相應(yīng)的掃描技術(shù)，又可以彌補(bǔ)CLSM系統(tǒng)視場(chǎng)小的缺點(diǎn)[1-4]。因此在理想情況下，CLSM能夠?qū)崿F(xiàn)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)成像。與普通光學(xué)顯微鏡相比，CLSM系統(tǒng)在獲得更高的橫向分辨率的同時(shí)，還具有較高的縱向分辨率。利用這種特性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的三維結(jié)構(gòu)重建和測(cè)量分析，為研究透明物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供了參考[5]。

1基本原理

CLSM的本質(zhì)是物像共軛，具體表現(xiàn)為：照明光源和探測(cè)器所處的位置分別與顯微物鏡焦點(diǎn)位置共軛，CLSM利用這種共軛關(guān)系抑制了光束離焦量和系統(tǒng)雜散光對(duì)光學(xué)分辨率和精度的影響，其基本原理如圖1所示[6]。CLSM利用針孔對(duì)光源的空間濾波和整形，形成點(diǎn)光源;點(diǎn)光源能量高度集中，避免了場(chǎng)光源照射時(shí)可能產(chǎn)生的衍射和散射光干擾的問(wèn)題;它通過(guò)顯微物鏡聚焦，在焦平面上形成一個(gè)聚焦光點(diǎn);待測(cè)樣品處的反射光或者熒光標(biāo)記物被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿著原光路返回分光鏡，分光鏡將返回的光束反射并通過(guò)聚焦成像透鏡經(jīng)由探測(cè)針孔會(huì)聚于探測(cè)器[3-4，7-8]。在CLSM中，只有在物鏡焦平面上的聚焦光點(diǎn)處的反射光或者熒光才能夠通過(guò)探測(cè)針孔，而焦平面以外的干擾光和散射光不能通過(guò)探測(cè)針孔，這就是共聚焦顯微系統(tǒng)具有很高光學(xué)分辨率的原因[9]。

CLSM系統(tǒng)主要由照明光源、聚光透鏡、針孔1、準(zhǔn)直透鏡、分光鏡、顯微物鏡、聚焦成像透鏡、針孔2、光電探測(cè)元件等構(gòu)成，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖2所示。聚光透鏡和準(zhǔn)直透鏡配合針孔1用于激光光束的整形和準(zhǔn)直;顯微物鏡用于將照明光束聚焦和收集被測(cè)樣品的反射光;聚焦成像透鏡用于將反射光會(huì)聚在探測(cè)針孔處，以便CCD探測(cè)器探測(cè)光信號(hào);分光鏡用于分光。分光光路采用平行光路，這樣可以在光路中插入分光棱鏡、偏振片等元件而不引入像差，還可以根據(jù)需要調(diào)整光路長(zhǎng)度。按功能CLSM系統(tǒng)可以分為三個(gè)子系統(tǒng)：準(zhǔn)直透鏡和顯微物鏡組成顯微聚焦系統(tǒng);光源，聚光透鏡和針孔1組成照明系統(tǒng);聚焦成像透鏡和顯微物鏡組成探測(cè)系統(tǒng)[10]。下面將介紹各子系統(tǒng)的光學(xué)設(shè)計(jì)結(jié)果。

2光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

2.1設(shè)計(jì)指標(biāo)

CLSM照明光源采用激光，因?yàn)榧す饧婢叻较蛐院蛦紊缘膬?yōu)勢(shì)。激光以平行光的形式進(jìn)入光學(xué)系統(tǒng)，CLSM光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)指標(biāo)如下：

（1） CLSM系統(tǒng)徑向光學(xué)分辨率不低于0.5 μm，軸向光學(xué)分辨率不低于0.8 μm。

（2） 照明激光波長(zhǎng)為450 nm，激光器輸出光束光斑直徑為4 mm。

（3） 根據(jù)照明系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和仿真結(jié)果確定針孔1的尺寸;根據(jù)探測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和仿真結(jié)果確定針孔2的尺寸。

（4） 在滿足CLSM系統(tǒng)分辨率的基礎(chǔ)上，確保顯微物鏡的工作距離不小于1.5 mm。

（5） 為了使所設(shè)計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)符合實(shí)際加工制造的條件，應(yīng)盡可能簡(jiǎn)化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，并采用K9玻璃作為光學(xué)系統(tǒng)的主要材料。

（6）為了便于后續(xù)設(shè)計(jì)，顯微物鏡的入瞳可以取整為D=6 mm?？紤]到系統(tǒng)工作距離不少于1.5 mm，去除相應(yīng)的機(jī)械結(jié)構(gòu)占用和設(shè)計(jì)余量，顯微物鏡工作距離應(yīng)取2 mm。

根據(jù)數(shù)值孔徑、放大率、工作距離等參數(shù)在《光學(xué)設(shè)計(jì)手冊(cè)》中選定一組由四個(gè)單透鏡組成的初始結(jié)構(gòu)。在初始結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行修改以滿足數(shù)值孔徑、放大率、工作距離等參數(shù)的設(shè)計(jì)要求，材料選用K9玻璃，優(yōu)化時(shí)只需要校正顯微物鏡的軸上點(diǎn)球差。波長(zhǎng)選擇450 nm，入射光瞳為6 mm，利用Zemax對(duì)修改后的顯微物鏡的初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行仿真和優(yōu)化，最終得到優(yōu)化后的顯微物鏡結(jié)構(gòu)參數(shù)，如表1所示，此外，根據(jù)Zemax的仿真結(jié)果列出了優(yōu)化后的顯微物鏡的主要參數(shù)，如表2所示。

2.2.2準(zhǔn)直透鏡的設(shè)計(jì)

準(zhǔn)直透鏡的作用是將針孔1整形和濾波后形成的點(diǎn)光源準(zhǔn)直為平行光束入射到顯微物鏡，同時(shí)使平行光束盡可能充滿顯微物鏡的入瞳。顯微物鏡入瞳為6 mm，所以準(zhǔn)直透鏡的出射光束直徑為6 mm。采用單透鏡，玻璃材料為K9，工作波長(zhǎng)為450 nm，在Zemax的afocal focus模式下對(duì)初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行像差自動(dòng)校正與平衡。優(yōu)化后最終得到準(zhǔn)直透鏡的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如表3所示，2D結(jié)構(gòu)圖如圖6所示，由此可知準(zhǔn)直透鏡出射光束在透鏡后表面20 mm處的光束半徑為3 mm，滿足顯微物鏡入瞳要求。

準(zhǔn)直透鏡的點(diǎn)列圖如圖7所示，出射光束發(fā)散角為0.092 mrad，準(zhǔn)直效果很好。準(zhǔn)直透鏡的MTF曲線如圖8所示，曲線接近衍射極限，透鏡的光學(xué)傳輸效率很高。

2.2.3顯微聚焦系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)

準(zhǔn)直透鏡和顯微物鏡組成顯微聚焦系統(tǒng)，對(duì)顯微聚焦系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，只需要校正軸上點(diǎn)球差。為了保證顯微物鏡的數(shù)值孔徑、焦距等特性參數(shù)不變，將準(zhǔn)直透鏡曲率半徑和厚度設(shè)為變量，顯微物鏡相關(guān)參數(shù)不變，進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化。此外，還需在默認(rèn)評(píng)價(jià)函數(shù)的基礎(chǔ)上添加REAY操作數(shù)控制準(zhǔn)直透鏡的出射光束半徑保持為3 mm，以保證光束能夠滿足顯微物鏡入瞳的要求。優(yōu)化后顯微聚焦系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)參數(shù)如表4所示，2D結(jié)構(gòu)圖如圖9所示。

由表4可知，優(yōu)化后顯微物鏡的結(jié)構(gòu)參數(shù)沒(méi)有變化，因此其數(shù)值孔徑、焦距等特性參數(shù)保持不變。顯微聚焦系統(tǒng)的點(diǎn)列圖和MTF曲線分別如圖10和圖11所示。由此可知：系統(tǒng)焦點(diǎn)彌散斑直徑小于2 μm，RMS半徑為0.355 μm，光斑集中在艾里斑范圍內(nèi);MTF曲線接近衍射極限，因此顯微聚焦系統(tǒng)具有極高的傳輸效率和分辨率。綜合上述評(píng)價(jià)，顯微聚焦系統(tǒng)的優(yōu)化結(jié)果十分理想。

2.3照明系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

照明系統(tǒng)由聚光透鏡和針孔1組成，其作用是將照明激光整形和濾波成為近似點(diǎn)光源，對(duì)可能進(jìn)入系統(tǒng)的雜散光起到抑制作用。聚光透鏡采用單透鏡，玻璃材料為K9，工作波長(zhǎng)為450 nm。根據(jù)提出的設(shè)計(jì)指標(biāo)可知，激光器輸出光束光斑直徑為4 mm，因此聚光透鏡入瞳為4 mm。

優(yōu)化后的照明系統(tǒng)結(jié)構(gòu)參數(shù)如表5所示，2D圖如圖12所示。針孔1位于聚光透鏡的焦點(diǎn)位置。照明系統(tǒng)的聚焦光斑同樣也是聚光透鏡的聚焦光斑，其點(diǎn)列圖如圖13所示，可知光斑直徑小于10 μm，RMS半徑為1.806 μm，較好地模擬了光斑很小的點(diǎn)光源。此外，根據(jù)圖14所示的照明系統(tǒng)離焦點(diǎn)列圖可知，在離焦50 μm處的離焦彌散斑直徑小于20 μm。根據(jù)以上仿真結(jié)果，為了使針孔1滿足對(duì)照明激光空間濾波和整形的要求，其直徑可以取為20 μm，厚度不超過(guò)0.1 mm。

照明系統(tǒng)的MTF曲線如圖15所示，曲線接近衍射極限，光學(xué)傳輸效率很高，優(yōu)化結(jié)果理想。

2.4探測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

2.4.1聚焦成像透鏡的設(shè)計(jì)

顯微物鏡成像在像方無(wú)限遠(yuǎn)處，根據(jù)共焦原理，要將物鏡焦平面處的被測(cè)樣品反射回來(lái)的光束聚焦在探測(cè)器上，需要有一個(gè)聚焦成像透鏡。為了充分收集顯微物鏡反射回來(lái)的光束，聚焦成像透鏡的入瞳直徑不能小于顯微物鏡的入瞳直徑，所以聚焦成像透鏡的入瞳取為6 mm，波長(zhǎng)為450 nm。考慮簡(jiǎn)化CLSM系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，采用單透鏡作為初始結(jié)構(gòu)，優(yōu)化后得到聚焦成像透鏡的結(jié)構(gòu)參數(shù)，如表6所示，聚焦成像透鏡的結(jié)構(gòu)圖如圖16所示，點(diǎn)列圖如圖17所示，MTF曲線如圖18所示。

由此可知：聚焦成像透鏡的入瞳直徑為6 mm，滿足顯微物鏡的入瞳要求;聚焦光斑直徑小于20 μm，RMS半徑為2.038 μm;光斑集中在艾里斑范圍內(nèi)，能量集中度很高;MTF曲線接近衍射極限，光學(xué)傳輸效率很高，說(shuō)明透鏡的優(yōu)化結(jié)果比較理想。

2.4.2探測(cè)系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)

將反向顯微物鏡、聚焦成像透鏡和分光鏡組合即組成探測(cè)系統(tǒng)。對(duì)探測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，只需要校正軸上點(diǎn)球差。為了避免顯微物鏡和聚焦成像透鏡的主要性能參數(shù)在優(yōu)化過(guò)程中發(fā)生不符合預(yù)期的變化，只需要將聚焦成像透鏡的工作距離設(shè)為變量。優(yōu)化后的探測(cè)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖19所示，探測(cè)系統(tǒng)點(diǎn)列圖如圖20所示。

由圖20可知，聚焦光路的彌散斑直徑小于20 μm，RMS半徑為6.364 μm。探測(cè)系統(tǒng)的離焦光斑點(diǎn)列圖如圖21所示，在離焦50 μm處的離焦彌散斑直徑小于20 μm。與確定針孔1尺寸的過(guò)程類似，為了使針孔2實(shí)現(xiàn)對(duì)探測(cè)激光的有效空間濾波，其尺寸應(yīng)取為直徑20 μm，厚度不超過(guò)0.1 mm。

由于探測(cè)系統(tǒng)的作用是將顯微物鏡收集的反射光聚焦在探測(cè)針孔上，聚焦能量越集中，光強(qiáng)就越容易達(dá)到探測(cè)器響應(yīng)的閾值，引起探測(cè)器的響應(yīng)。因此光能量的傳輸效率可以作為評(píng)價(jià)探測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)結(jié)果的重要指標(biāo)。下面將從MTF曲線和OPD函數(shù)出發(fā)，進(jìn)一步評(píng)價(jià)探測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)結(jié)果。

探測(cè)系統(tǒng)的MTF曲線如圖22所示，可以看到曲線接近衍射極限，這說(shuō)明探測(cè)系統(tǒng)的光學(xué)傳輸效率很高，成像質(zhì)量很好，設(shè)計(jì)結(jié)果理想。

3結(jié)論

本文設(shè)計(jì)了一種CLSM光學(xué)系統(tǒng)，采用結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的球面透鏡實(shí)現(xiàn)了顯微聚焦系統(tǒng)、照明系統(tǒng)和探測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)。其中，顯微物鏡的聚焦彌散斑直徑小于1 μm，數(shù)值孔徑為0.49，工作距離大于2 mm，同時(shí)系統(tǒng)徑向和軸向光學(xué)分辨率分別為0.400 μm和0.772 μm，均達(dá)到設(shè)計(jì)要求。顯微聚焦系統(tǒng)的聚焦彌散斑直徑小于2 μm，照明系統(tǒng)聚焦彌散斑直徑小于10 μm，探測(cè)系統(tǒng)的聚焦彌散斑直徑小于20 μm。根據(jù)照明系統(tǒng)和探測(cè)系統(tǒng)的離焦點(diǎn)列圖確定了針孔1和針孔2的尺寸。此外，各子系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)曲線均接近衍射極限，表明光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和優(yōu)化結(jié)果比較理想，光學(xué)傳輸效率很高。綜上，該光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單緊湊、徑向和軸向分辨率較高，可以滿足醫(yī)學(xué)、材料、生物和光學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域?qū)す夤簿劢癸@微系統(tǒng)的需求。

此外，本文設(shè)計(jì)的系統(tǒng)仍有可以改進(jìn)的地方，如系統(tǒng)的物鏡數(shù)值孔徑較小，可以采用非球面鏡提高物鏡的數(shù)值孔徑，同時(shí)還可以簡(jiǎn)化物鏡的結(jié)構(gòu)，減少鏡片數(shù)量，從而進(jìn)一步提高CLSM的光學(xué)分辨率和檢測(cè)效率。

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（編輯：劉鐵英）