硝酸鹽對(duì)小麥幼苗根系早期生長(zhǎng)和抗氧化特性的影響

顧澤瑋 單友田 陳小雁 蔡冬梅 陳艷蝶 景紅娟

摘要：以小麥（Triticum aestivum L.）秋樂2122作為供試材料，以不含硝酸鹽的Hoagland溶液為對(duì)照，研究不同濃度硝酸鹽對(duì)小麥根系發(fā)育的影響。利用分光光度計(jì)和組化染色法檢測(cè)根尖細(xì)胞中O2-·和H2O2含量，并測(cè)定細(xì)胞內(nèi)相關(guān)氧化還原酶活性與還原型谷胱甘肽（GSH）含量。結(jié)果表明，硝酸鹽能夠顯著增加小麥根尖細(xì)胞中O2-·而不是H2O2含量;高濃度硝酸鹽（60 mmol/L）處理O2-·含量顯著高于低濃度硝酸鹽（10 mmol/L）處理。低濃度硝酸鹽顯著降低SOD酶活性和GSH含量，提高POD、谷胱甘肽還原酶（GR）和GSH-PX酶活性，使根部細(xì)胞具有良好的抗氧化能力，促進(jìn)小麥根系生長(zhǎng)。高濃度硝酸鹽抑制小麥幼苗根系生長(zhǎng)，是由于降低SOD與GSH-PX酶活性;雖然增加POD和GR酶活性，但是仍無法緩解根部細(xì)胞O2-·過量積累而造成的氧化損傷。所以不同濃度硝酸鹽通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)O2-·含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥根系生長(zhǎng)的調(diào)控。

關(guān)鍵詞：硝酸鹽;活性氧;小麥（Triticum aestivum L.）;GSH;根系

中圖分類號(hào)：S512.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）23-0061-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.23.014? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

硝酸鹽是植物利用的主要氮源，正常情況下土壤中其濃度小于1 mmol/L，但是隨著氮肥的大量使用，其濃度可高達(dá)70 mmol/L[1]。小麥（Triticum aestivum L.）作為一種典型的單子葉須根系作物，根多、根深、根壯是其高產(chǎn)的基礎(chǔ)。小麥根系發(fā)育不僅受遺傳物質(zhì)控制，而且生長(zhǎng)環(huán)境因素也會(huì)極大地影響根發(fā)育[2]。研究表明，過量硝酸鹽會(huì)抑制根系生長(zhǎng)發(fā)育[3]，而缺氮條件在抑制小麥幼苗生長(zhǎng)的同時(shí)可以刺激根生長(zhǎng)[4]。此外，硝酸鹽還作為信號(hào)分子，通過生長(zhǎng)素信號(hào)通路調(diào)節(jié)初生根生長(zhǎng)與側(cè)根起始發(fā)育[5]。因此，硝酸鹽對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育起關(guān)鍵作用。

植物吸收的硝酸鹽在內(nèi)體還原同化生成游離氨，其通過抑制線粒體內(nèi)呼吸鏈的電子傳遞[5]，誘導(dǎo)生成過量的超氧陰離子（O2-·）[6]，而且O2-·通過超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）酶促歧化生成半衰期更長(zhǎng)的過氧化氫（H2O2）[7]。生成的H2O2可在過氧化氫酶（Catalase，CAT）和過氧化物酶（Peroxidase，POD）作用下生成水分子。O2-·與H2O2作為植物體中主要的兩種活性氧（Reactive oxygen species，ROS），低濃度時(shí)作為重要信號(hào)分子調(diào)節(jié)根系生長(zhǎng)發(fā)育[8-11]。還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）通過維持根尖細(xì)胞氧化還原平衡，在根尖生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用[8]。

硝酸鹽通過硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入植物細(xì)胞調(diào)控根系生長(zhǎng)發(fā)育[1，4]。但是，硝酸鹽調(diào)控根系發(fā)育是否與ROS有關(guān)，鮮見報(bào)道。因此，研究不同濃度硝酸鹽對(duì)O2-·、H2O2含量水平與胞內(nèi)氧化還原酶活性和谷胱甘肽含量的影響，對(duì)闡明硝酸鹽作用于小麥根系生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理有重要意義，也為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中合理施加硝酸鹽提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料與培養(yǎng)

材料為冬小麥秋樂2122，購(gòu)自河南秋樂種業(yè)科技股份有限公司。選取子粒飽滿，大小均勻，無病蟲害的小麥種子，用0.5%次氯酸鈉消毒15 min，室溫下黑暗萌發(fā)24 h，在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中用去離子水培養(yǎng)1 d后備用。以不含有硝酸鹽的改良Hoagland溶液為0 mmmol/L對(duì)照，含有10、60 mmmol/L硝酸鹽的改良Hoagland溶液為處理繼續(xù)培養(yǎng)6 d，用于形態(tài)和生理指標(biāo)測(cè)定。Hoagland溶液改良配方見表1，在0 mmol/L溶液中為維持滲透和電荷平衡，用Cl-代替處理液的硝酸鹽。培養(yǎng)條件為25～20 ℃，光照度4 000～4 500 lx，14 h光照/10 h黑暗。

1.2? 測(cè)定指標(biāo)與方法

測(cè)定上述培養(yǎng)6 d小麥幼苗的苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)和根數(shù)。根部O2-·含量測(cè)定采用羥胺氧化法[11]，H2O2含量測(cè)定采用鉬酸銨法[12]，根尖細(xì)胞O2-·與H2O2原位檢測(cè)分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）[13]與3-3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）[14]染色法。SOD活性采用NBT光還原法測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定[15]，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[15]測(cè)定。GSH和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量采用A061-1試劑盒測(cè)定，GR活力采用A062試劑盒測(cè)定，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力采用A005試劑盒測(cè)定。上述指標(biāo)測(cè)定均設(shè)3組平行，重復(fù)3次。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

利用Photoshop軟件進(jìn)行圖片編輯;利用Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算、統(tǒng)計(jì)分析及繪圖;采用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同濃度硝酸鹽對(duì)小麥苗期生長(zhǎng)的影響

利用一系列濃度的硝酸鹽連續(xù)處理小麥幼苗6 d，檢測(cè)小麥幼苗根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)等形態(tài)指標(biāo)。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，分別選取10、60 mmol/L硝酸鹽進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由表2可知，10 mmol/L硝酸鹽顯著促進(jìn)小麥幼苗根的生長(zhǎng)，其根系長(zhǎng)度比對(duì)照增加了21%。60 mmol/L硝酸鹽對(duì)小麥幼苗根的生長(zhǎng)有抑制作用，其根長(zhǎng)與對(duì)照相比降低了8.1%，且苗長(zhǎng)也降低了7.9%。但是硝酸鹽對(duì)根的數(shù)量沒有顯著影響。因此，10 mmol/L硝酸鹽顯著促進(jìn)小麥幼苗根系生長(zhǎng)，而60 mmol/L硝酸鹽則抑制根系生長(zhǎng)。

2.2? 不同濃度硝酸鹽對(duì)小麥幼苗O2-·與H2O2含量的影響

適量的ROS作為信號(hào)分子，在植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[8-11]。為了探討不同濃度硝酸鹽促進(jìn)和抑制小麥根系發(fā)育的機(jī)理，檢測(cè)了小麥根尖細(xì)胞中O2-·和H2O2含量。由圖1A可知，O2-·主要位于小麥根尖分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)，10、60 mmol/L硝酸鹽處理顯著增加O2-·含量。圖1B結(jié)果表明，H2O2含量均勻分布在根尖的各個(gè)區(qū)域，而硝酸鹽處理能夠增加小麥根尖分生區(qū)細(xì)胞H2O2含量。圖1C的結(jié)果表明，10、60 mmol/L硝酸鹽處理的O2-·含量分別比對(duì)照提高13.5%和101.7%，即60 mmol/L硝酸鹽處理的小麥根尖細(xì)胞中O2-·含量比10 mmol/L硝酸鹽高。圖1B和圖1D結(jié)果均表明，硝酸鹽處理對(duì)小麥根尖細(xì)胞H2O2含量影響不顯著。因此，硝酸鹽處理能夠顯著增加小麥根尖細(xì)胞中O2-·含量，而對(duì)H2O2含量影響不大。

2.3? 不同濃度硝酸鹽對(duì)小麥幼苗根系氧化還原酶系活性及GSH含量的影響

為了探討小麥根尖細(xì)胞中O2-·含量升高的原因，進(jìn)一步檢測(cè)了一系列與ROS代謝相關(guān)酶的活性。如圖2A所示，與對(duì)照相比，10 mmol/L硝酸鹽顯著降低SOD活性，降低了21.0%。相反，硝酸鹽處理能夠顯著提高POD活性，10、60 mmol/L硝酸鹽處理分別提高POD活性11.8%和147.5%（圖2B）。由圖2C可知，硝酸鹽處理對(duì)分解H2O2的酶CAT活性影響不大。因此，硝酸鹽能夠顯著提高POD活性，而只有低濃度硝酸鹽能夠降低SOD酶活性。

谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原物質(zhì)，在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡即內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中起關(guān)鍵作用[8]。10 mmol/L硝酸鹽處理顯著降低小麥根尖細(xì)胞中GSH含量，而60 mmol/L硝酸鹽則顯著增加GSH含量，其含量分別為對(duì)照的82.2%和131.7%（圖3A）。而GSH的氧化形式GSSG在不同濃度硝酸鹽處理?xiàng)l件下無顯著差異（圖3B）。GR是還原性GSH再生的一種關(guān)鍵酶，10 mmol/L硝酸鹽和60 mmol/L硝酸鹽處理GR活性分別是對(duì)照的11.1倍和15.8倍（圖3C）。GSH-PX是一種通過氧化GSH降解H2O2的酶，從圖3D中可知，10 mmol/L硝酸鹽提高GSH-PX酶活性11.2%，而60 mmol/L硝酸鹽降低GSH-PX酶活性23.6%。

3? 小結(jié)與討論

研究發(fā)現(xiàn)，低濃度硝酸鹽（10 mmol/L）能夠促進(jìn)小麥根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，而高濃度硝酸鹽（60 mmol/L）反而會(huì)抑制小麥根系生長(zhǎng)，再次證明了硝酸鹽對(duì)根系生長(zhǎng)發(fā)育的雙重作用[3，4]。低濃度硝酸鹽能夠誘導(dǎo)根部O2-·濃度升高，而一定濃度ROS能夠促進(jìn)細(xì)胞壁松弛，有利于細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[14]。高濃度硝酸鹽誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生大量O2-·，使得細(xì)胞內(nèi)氧化還原動(dòng)態(tài)平衡改變，同時(shí)也會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)與結(jié)構(gòu)損傷，最終表現(xiàn)為抑制小麥幼苗生長(zhǎng)。

細(xì)胞內(nèi)參與ROS代謝的酶類主要是SOD、POD和CAT[15]。硝酸鹽能夠顯著提高POD活性，卻對(duì)CAT活性影響不顯著，而只有低濃度硝酸鹽降低SOD酶活性。SOD可以將O2-·轉(zhuǎn)化為H2O2[7]，其活性降低是硝酸鹽誘導(dǎo)O2-·升高的原因之一。硝酸鹽誘導(dǎo)O2-·升高勢(shì)必造成細(xì)胞內(nèi)過氧化物濃度升高，而POD活性升高能夠及時(shí)消除由于O2-·升高對(duì)細(xì)胞造成的損傷;同時(shí)，POD也是催化H2O2分解的酶，其活性升高也是細(xì)胞H2O2含量不變的原因。因此，硝酸鹽誘導(dǎo)生成的H2O2主要依賴于POD降解而非CAT。這可能與CAT活性并非僅僅受到底物與產(chǎn)物影響，還受到NADPH氧化酶活性及轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控有關(guān)[7]。所以，植物體可能更傾向于維持低H2O2含量狀態(tài)，以此來保持細(xì)胞對(duì)H2O2這種信號(hào)分子類似于Ca2+的敏感性[16]，使得生長(zhǎng)能夠?qū)Νh(huán)境的變化快速作出應(yīng)答。

除了上述參與ROS代謝的抗氧化酶以外，GSH也是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡的重要物質(zhì)[8]。高濃度硝酸鹽可以誘導(dǎo)根部細(xì)胞內(nèi)GSH升高，而低濃度硝酸鹽則降低GSH含量，但其氧化型GSSG的含量與對(duì)照無差異。因此，高濃度硝酸鹽通過上調(diào)GSH來維持氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，而低濃度硝酸鹽則不需要，反而降低了GSH含量。因此，高濃度硝酸鹽為了維持較高的GSH含量，通過提高GR活性來實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步證明了GR和GSH通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡，從而調(diào)節(jié)根的生長(zhǎng)[8]。但是，隨著細(xì)胞內(nèi)O2-·持續(xù)升高，高濃度硝酸鹽GSH-PX活性降低，而低濃度硝酸鹽GSH-PX活性較高。另外，高濃度硝酸鹽增加POD活性，說明除了GSH-PX以外，其他POD是清除升高ROS的主力軍。

綜上所述，高濃度硝酸鹽處理下O2-·大量積累，由于已經(jīng)超出了細(xì)胞內(nèi)氧化還原體系所能調(diào)節(jié)的能力，最終表現(xiàn)為抑制生長(zhǎng);而低濃度硝酸鹽O2-·適量積累，則是作為信號(hào)分子促進(jìn)了根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[17，18]。

參考文獻(xiàn)：

[1] KRAPP A，DAVID LC，CHARDIN C，et al. Nitrate transport and signalling in Arabidopsis[J].Journal of Experimental Botany，2014， 65（3）：789-798.

[2] TIAN H Y，SMET I D，DING Z J，et al. Shaping a root system：Regulating lateral versus primary root growth[J].Trends Plant in Science，2014，19（7）：426-431.

[3] REP■？魣K M，PALOVE-BALANG P，DU■AIOV？魣 Z K，et al. High nitrogen supply affects the metabolism of Matricaria chamomilla leaves[J].Plant Growth Regulation，2014，73（2）：147-153.

[4] GUO T，XUAN H，YANG Y，et al. Transcription analysis of genes encoding the wheat root transporter NRT1 and NRT2 families during nitrogen starvation[J].Journal of Plant Growth Regulation，2014，33：837-848.

[5] BOUGUYON E，PERRINE-WALKER F，PERVENT M，et al. Nitrate controls root development through post-transcriptional regulation of the NRT1.1/NPF6.3 transporter/sensor[J].Plant Physiology，2016，172（2）：1237-1248.

[6] 景紅娟，李翠香，王俊峰，等.NOXs生成的活性氧對(duì)根生長(zhǎng)和發(fā)育調(diào)控的研究進(jìn)展[J].植物生理學(xué)報(bào)，2013，49（5）：417-424.

[7] MITTLER R，BLUMWALD E. The roles of ROS and ABA in systemic acquired acclimation[J].The Plant Cell，2015，27（1）：64-70.

[8] YU X，PASTERNAK T，EIBLMEIER M，et al. Plastid-localized glutathione reductase2-regulated glutathione redox status is essential for Arabidopsis root apical meristem maintenance[J].Plant Cell，2013，25（11）：4451-4468.

[9] FOREMAN J，DEMIDCHIK V，BOTHWELL J H，et al. Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth[J].Nature，2003，422：442-446.

[10] MONSHAUSEN G B，BIBIKOVA T N，MESSERLI M A，et al. Oscillations in extracellular pH and reactive oxygen species modulate tip growth of Arabidopsis root hairs[J].PNAS，2007， 104（52）：20996-21001.

[11] DUNAND C，CREVECOEUR M，PENEL C. Distribution of superoxide and hydrogen peroxide in Arabidopsis root and their influence on root development：Possible interaction with peroxidases[J].New Phytologist，2007，174（2）：332-341.

[12] TEWARI R K，KIM S，HAHAN E J，et al. Involvement of nitric oxide-induced NADPH oxidase in adventitious root growth and antioxidant defense in Panax ginseng[J].Plant Biotechnology Reports，2008，2（2）：113-122.

[13] 高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，2006.

[14] GILL S S，TUTEJA N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J].Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：909-930.

[15] EVANS M J，CHOI W，GILROY S，et al. A ROS-assisted calcium wave dependent on the AtRBOHD NADPH oxidase and TPC1 cation channel propagates the systemic response to salt stress[J].Plant Physiology，2016，171（3）：1771-1784.

[16] MORGAN M J，LEHMANN M，SCHWARZL？魧NDER M，et al. Decrease in manganese superoxide dismutase leads to reduced root growth and affects tricarboxylic acid cycle flux and mitochondrial redox homeostasis[J].Plant Physiology，2008，147：101-114.

[17] ZHANG M，WANG C，LIN Q，et al. A tetratricopeptide repeat domain-containing protein SSR1 located in mitochondria is involved in root development and auxin polar transport in Arabidopsis[J]. Plant Journal，2015，83（4）：582-99.

[18] WEI J，ZHENG Y，F(xiàn)ENG H，et al. OsNRT2.4 encodes a dual-affinity nitrate transporter and functions in nitrate-regulated root growth and nitrate distribution in rice[J].Journal of Experimental Botany，2018，69（5）：1095-1107.