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    慢速冷凍卵裂期胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植的臨床結(jié)局分析

    2018-03-01 03:21:20莫美蘭孫青李觀貴萬(wàn)才云陳培林黃菊黃麗施曾勇熊風(fēng)
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2018年2期
    關(guān)鍵詞:差異研究

    莫美蘭,孫青,李觀貴,萬(wàn)才云,陳培林,黃菊,黃麗施,曾勇,熊風(fēng)

    (深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心,深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,深圳中山生殖與遺傳研究所,深圳 518045)

    胚胎冷凍保存廣泛應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)中,主要有慢速冷凍法和玻璃化冷凍法[1]。早期相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間慢速冷凍法在臨床上廣泛使用,但近幾年隨著玻璃化法的成功發(fā)展,逐漸取代慢速冷凍法,成為輔助生殖實(shí)驗(yàn)室最主要的冷凍方法[2]。然而,每個(gè)中心的胚胎庫(kù)里幾乎都保存有一定數(shù)量的早期慢速冷凍胚胎。這些胚胎存在以下特點(diǎn):慢速冷凍保存、保存年份較長(zhǎng)、患者幾近高齡、冷存胚胎數(shù)量多等。基于上述特點(diǎn),為了獲得更優(yōu)的臨床結(jié)局,部分中心主張或者是應(yīng)患者要求,嘗試將慢速冷凍卵裂期胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚期,篩選出更具活力的胚胎進(jìn)行移植。但是,這種移植策略是否能夠有效地改善臨床結(jié)局,提高妊娠成功率,尚缺乏相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道,尤其是針對(duì)保存時(shí)間長(zhǎng)的慢速冷凍胚胎。本研究對(duì)深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心2013~2016年慢速冷凍胚胎復(fù)蘇周期進(jìn)行回顧性分析,對(duì)復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植與直接卵裂期移植的臨床結(jié)局進(jìn)行對(duì)比,為臨床選擇移植策略提供參考。

    資料與方法

    一、研究對(duì)象

    選取2013年1月至2016年12月深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心慢速冷凍胚胎復(fù)蘇周期為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)復(fù)蘇的胚胎為第3天(D3)卵裂期胚胎;(2)同一患者復(fù)蘇的胚胎來(lái)自于同一取卵周期。排除混合移植其他周期胚胎的周期。所有患者在被告知囊胚培養(yǎng)與移植的優(yōu)勢(shì)、風(fēng)險(xiǎn)以及慢速冷凍D3胚胎復(fù)蘇后移植成功率的基礎(chǔ)上,自主選擇復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚再移植或直接行卵裂期胚胎移植,并簽署相應(yīng)的知情同意書(shū)。根據(jù)患者自主選擇的結(jié)果,將研究對(duì)象分為兩組:卵裂期移植組和囊胚移植組。卵裂期移植組即慢速?gòu)?fù)蘇后直接行卵裂期胚胎移植,共55個(gè)復(fù)蘇周期。囊胚移植組即復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚移植,共57個(gè)復(fù)蘇周期。

    二、方法

    1.慢速冷凍與復(fù)蘇:室溫下胚胎在含20%人血清白蛋白(HSA)(SAGE公司,美國(guó))的改良人輸卵管液(MHTF)(SAGE公司,美國(guó))中沖洗3~5遍,然后依次移至含20%HSA+1.5 M丙二醇、20%HSA+1.5 M丙二醇+0.1 M蔗糖的MHTF中孵育10 min后裝入麥管,再將麥管放入程序冷凍儀(PLANER公司,英國(guó))的支架上。按以下冷凍程序進(jìn)行冷凍:20℃開(kāi)始,以1℃/min降至2℃,停留8 min,以2℃/min降至-7℃,停留10 min,植冰,停留5 min,以0.3℃/min降至-30℃,以10℃/min降至-150℃。復(fù)蘇胚胎時(shí),在液氮罐中取出麥管,室溫?fù)u晃冷凍麥管40 s;將冷凍麥管放入30℃恒溫水浴箱中,停留20 s;剪斷麥管,將胚胎依次浸入含20%HSA+1.0 M丙二醇+0.2 M蔗糖、20%HSA+0.5 M丙二醇+0.2 M蔗糖、20%HSA+0.2 M蔗糖、20%HSA的MHTF解凍液中各5 min,觀察復(fù)蘇胚胎存活情況,復(fù)蘇后卵裂球存活率≥50%的胚胎定義為存活胚胎。最后將復(fù)蘇后的胚胎移入ART-1029胚胎培養(yǎng)液中(SAGE公司,美國(guó)),待移植或繼續(xù)培養(yǎng)。

    2.囊胚培養(yǎng):復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)采用ART-1029胚胎培養(yǎng)液,培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)。將復(fù)蘇后的胚胎根據(jù)不同質(zhì)量,每個(gè)微滴1~3枚胚胎,移至提前平衡好的囊胚培養(yǎng)皿中。放置37℃、5%CO2、5%O2的三氣培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48~72 h后觀察囊胚形成情況,并根據(jù)Gardner & Schoolcraft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)囊胚進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。

    3.內(nèi)膜準(zhǔn)備與胚胎移植:對(duì)于月經(jīng)周期正常且排卵規(guī)律的患者采用自然周期方案,即根據(jù)陰道超聲監(jiān)測(cè),月經(jīng)天數(shù)≥10 d,優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥14 mm,子宮內(nèi)膜達(dá)到7~8 mm以上,排卵后D3進(jìn)行卵裂期胚胎、D5進(jìn)行囊胚移植。月經(jīng)周期不正?;蚺怕巡灰?guī)律的患者采用人工周期方案,即月經(jīng)D3起口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè),拜耳,德國(guó))4 mg/d×5 d,根據(jù)內(nèi)膜情況調(diào)整劑量及天數(shù)。15 d后B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度7~8 mm以上時(shí),肌肉注射黃體酮60 mg/d至移植日。B超介導(dǎo)下行胚胎移植術(shù)。

    4.觀察指標(biāo):分析實(shí)驗(yàn)組胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成率,兩組患者復(fù)蘇后第1次移植周期的種植率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率及抱嬰率等臨床結(jié)局。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析,均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),率的差異性分析采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、慢速?gòu)?fù)蘇情況及復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成率

    根據(jù)入選時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn),共計(jì)入選112個(gè)慢速?gòu)?fù)蘇周期,復(fù)蘇卵裂期胚胎853枚,復(fù)蘇存活率為72.57%。囊胚移植組共培養(yǎng)囊胚539枚,形成囊胚159枚,囊胚形成率為29.50%,其余未形成囊胚,自然退化或溶解。

    二、兩組移植患者基本資料比較

    本研究收集的臨床結(jié)局是復(fù)蘇后第1次移植周期的結(jié)局,不考慮重復(fù)周期的情況。其中,卵裂期移植組55個(gè)復(fù)蘇周期中,4個(gè)周期因胚胎溶解取消移植,6個(gè)為重復(fù)周期,剩下第1次移植周期45個(gè)。囊胚移植組57個(gè)復(fù)蘇周期中,1個(gè)周期因胚胎溶解取消繼續(xù)培養(yǎng),12個(gè)周期無(wú)囊胚形成取消移植,2個(gè)周期因個(gè)人原因取消移植,1個(gè)為重復(fù)周期,剩下第1次移植周期41個(gè)。分析兩組患者基本資料如表1所示。移植時(shí)女方年齡、取卵時(shí)女方年齡、胚胎平均保存時(shí)間、黃體轉(zhuǎn)化日的內(nèi)膜厚度比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

    三、兩組移植患者臨床結(jié)局比較

    卵裂期移植組移植慢速?gòu)?fù)蘇D3胚胎119枚,其中優(yōu)質(zhì)胚胎比例為58.82%。囊胚移植組移植囊胚57枚,其中優(yōu)質(zhì)囊胚的比例為47.37%。兩組患者移植優(yōu)質(zhì)胚胎的比例無(wú)顯著性差異(P>0.05),但是卵裂期移植組的平均移植胚胎數(shù)顯著高于囊胚移植組(P<0.05)。卵裂期移植組的種植率稍低于囊胚移植組,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。卵裂期移植組與囊胚移植組的臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率、抱嬰率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

    表1 兩組患者基本資料比較(-±s)

    表2 兩組患者移植臨床結(jié)局比較 [(-±s),%]

    注:*與卵裂期移植組比較,P<0.05;a3個(gè)周期產(chǎn)科結(jié)局失訪;b2個(gè)周期截至投稿日尚未出產(chǎn)科結(jié)局

    討 論

    近幾年,隨著胚胎培養(yǎng)技術(shù)的提高,囊胚培養(yǎng)與移植逐漸成為輔助生殖技術(shù)發(fā)展趨勢(shì),大家逐漸認(rèn)識(shí)到囊胚移植相比卵裂期胚胎移植而言,具有明顯優(yōu)勢(shì)[3],包括:(1)對(duì)胚胎做進(jìn)一步篩選和修復(fù);(2)有機(jī)會(huì)挑選到更具發(fā)育潛力的胚胎用于移植;(3)囊胚期胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更佳,易使胚胎成功種植,并減少移植胚胎數(shù)目,減少多胎的發(fā)生。因此,一部分生殖中心開(kāi)始由卵裂期胚胎移植逐步推向囊胚移植,以期獲得更好的臨床結(jié)局[4-5]。而且,一部分患者也逐漸對(duì)囊胚的優(yōu)勢(shì)有所了解并認(rèn)同,開(kāi)始主動(dòng)選擇囊胚移植,期望獲得更佳的臨床妊娠。早年間慢速冷凍的卵裂期胚胎由于保存時(shí)間長(zhǎng)、母體年齡大等特點(diǎn),主觀的臨床預(yù)后結(jié)局不佳。而且大部分患者可能保存有超過(guò)3枚的卵裂期胚胎,為了進(jìn)一步篩選有發(fā)育潛能的胚胎移植,提高單次移植的成功率,復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植是最常使用的策略。然而,該策略的有效性尚缺乏相應(yīng)文章的報(bào)道。因此,本研究對(duì)我們中心復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植與直接卵裂期移植的臨床結(jié)局進(jìn)行分析。

    本研究納入2013年1月至2016年12月慢速?gòu)?fù)蘇周期112個(gè),復(fù)蘇D3卵裂期胚胎853枚,復(fù)蘇存活率為72.57%,與已有報(bào)道的慢速解凍復(fù)蘇存活率79.10%[6]相當(dāng),高于王華等[7]報(bào)道的57.69%,低于張寧媛等[8]報(bào)道的81.25%。產(chǎn)生差異的原因一方面可能是冷凍胚胎的優(yōu)胚比例存在差異,另一方面也可能由于冷凍儲(chǔ)存時(shí)間的不同。我們中心自2010年開(kāi)始逐漸由慢速冷凍向玻璃化冷凍方法過(guò)渡,本研究中的慢速冷凍胚胎的平均儲(chǔ)存時(shí)間超過(guò)7年(表1)。同時(shí),本研究也驗(yàn)證了慢速?gòu)?fù)蘇存活率遠(yuǎn)低于目前廣泛使用的玻璃化冷凍方法[9]。因此,慢速冷凍復(fù)蘇后,無(wú)可用胚胎、取消移植的比例較高。本研究中卵裂期移植組共有55個(gè)復(fù)蘇周期,4個(gè)周期因胚胎溶解取消移植。囊胚移植組共有57個(gè)復(fù)蘇周期,1個(gè)周期因胚胎溶解取消培養(yǎng)。囊胚移植組培養(yǎng)胚胎539枚,形成159枚囊胚,12個(gè)周期因無(wú)囊胚形成而取消移植,囊胚形成率為29.50%,遠(yuǎn)低于本中心D3新鮮剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成率55.13%(2016年數(shù)據(jù),未發(fā)表)以及報(bào)道的玻璃化D3冷凍胚胎復(fù)蘇后囊胚形成率45.10%[10]和54.7%[11]。但是與唐永梅等[12]2012年報(bào)道的復(fù)蘇胚胎囊胚形成率32.85%相當(dāng),該研究中僅部分卵裂期胚胎采用慢速冷凍-快速?gòu)?fù)溫法,仍有一部分采用的是玻璃化冷凍解凍法。影響囊胚形成的因素很多,包括培養(yǎng)的卵裂期胚胎的質(zhì)量、患者年齡、體重指數(shù)(BMI)水平、FSH劑量等[13],這可能也是產(chǎn)生上述差異的原因。

    囊胚移植與卵裂期胚胎移植的對(duì)比研究很多[14],2016年Glujovsky等[15]綜述了27項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)的研究結(jié)果,認(rèn)為新鮮囊胚移植有更高的臨床妊娠率和活嬰出生率。然而,最新一篇Meta分析入選了12項(xiàng)RCT研究總結(jié)提出,囊胚優(yōu)于卵裂期胚胎移植的證據(jù)較弱,尚需要設(shè)計(jì)更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腞CT研究證實(shí)[16]。Carvalho等[17]2016年最新研究結(jié)果又表明,新鮮周期囊胚與卵裂期移植臨床結(jié)局存在差異,而復(fù)蘇周期中并無(wú)這種差異。上述研究表明目前對(duì)于囊胚移植還是卵裂期移植尚存在爭(zhēng)議。在本項(xiàng)研究中我們分析復(fù)蘇后第1次移植周期的結(jié)局,規(guī)避多周期患者因素對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的干擾。觀察發(fā)現(xiàn)患者移植年齡、取卵年齡、胚胎平均保存時(shí)間、黃體轉(zhuǎn)化日的內(nèi)膜厚度方面均無(wú)顯著性差異。由于胚胎屬性的不同,卵裂期胚胎移植1~3枚,囊胚移植1~2枚,因此,卵裂期胚胎移植組的平均移植胚胎數(shù)顯著高于囊胚移植組(P<0.05)。但是兩組移植胚胎中優(yōu)質(zhì)胚胎的比例無(wú)顯著性差異(P>0.05)。此條件下,種植率方面,卵裂期胚胎移植組有低于囊胚移植組的趨勢(shì),這與報(bào)道的囊胚移植可能具有更高的種植潛能[18]是相符的,但是并未呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),這可能與本研究中卵裂期胚胎移植組優(yōu)質(zhì)胚胎的比例略高于囊胚移植組有關(guān)。妊娠率方面,卵裂期移植組的臨床妊娠率為44.44%,略高于囊胚移植組的39.02%,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)蘇后卵裂期移植的臨床妊娠率與王華等[7]報(bào)道的39.19%基本一致。王欽等[10]對(duì)玻璃化冷凍的D3卵裂期胚胎凍融后培養(yǎng)至囊胚移植的分析結(jié)果表明,卵裂期胚胎凍融后培養(yǎng)至囊胚移植可以得到較好的臨床結(jié)果,移植周期臨床妊娠率為71.8%,顯著高于對(duì)照組的43.9%。妊娠率的差異主要可能是由于患者的平均年齡以及移植胚胎數(shù)和胚胎質(zhì)量的不同。另一方面,與王欽等[10]對(duì)玻璃化冷凍胚胎的研究結(jié)果不同,本研究中慢速冷凍胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚,相比直接移植卵裂期胚胎而言,并未見(jiàn)改善臨床結(jié)局。這可能是由于入選人群的差異,本研究中冷凍胚胎復(fù)蘇移植患者年齡偏大,胚胎保存年份較長(zhǎng),加上慢速冷凍技術(shù)本身的局限性,其預(yù)后結(jié)局可能較差。根據(jù)美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)(ASRM)與美國(guó)輔助生殖技術(shù)協(xié)會(huì)(SART)實(shí)踐委員會(huì)共識(shí),預(yù)后差的患者囊胚移植并不能改善臨床結(jié)局[19]。因此,權(quán)衡兩種移植策略,囊胚期移植確實(shí)能夠顯著減少平均移植胚胎數(shù),有降低多胎妊娠的可能[15,20]。但是也增加了無(wú)可移植胚胎的風(fēng)險(xiǎn),而且囊胚培養(yǎng)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[21]。

    綜上,早期慢速冷凍的D3卵裂期胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植的策略有利有弊,總體而言對(duì)臨床結(jié)局的改善不大。各中心需要綜合考慮患者意愿及具體情況,選擇合適的慢速冷凍胚胎復(fù)蘇后移植策略。

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