慢速冷凍卵裂期胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植的臨床結(jié)局分析

莫美蘭，孫青，李觀貴，萬(wàn)才云，陳培林，黃菊，黃麗施，曾勇，熊風(fēng)

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

胚胎冷凍保存廣泛應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)中，主要有慢速冷凍法和玻璃化冷凍法[1]。早期相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間慢速冷凍法在臨床上廣泛使用，但近幾年隨著玻璃化法的成功發(fā)展，逐漸取代慢速冷凍法，成為輔助生殖實(shí)驗(yàn)室最主要的冷凍方法[2]。然而，每個(gè)中心的胚胎庫(kù)里幾乎都保存有一定數(shù)量的早期慢速冷凍胚胎。這些胚胎存在以下特點(diǎn)：慢速冷凍保存、保存年份較長(zhǎng)、患者幾近高齡、冷存胚胎數(shù)量多等?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，為了獲得更優(yōu)的臨床結(jié)局，部分中心主張或者是應(yīng)患者要求，嘗試將慢速冷凍卵裂期胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚期，篩選出更具活力的胚胎進(jìn)行移植。但是，這種移植策略是否能夠有效地改善臨床結(jié)局，提高妊娠成功率，尚缺乏相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道，尤其是針對(duì)保存時(shí)間長(zhǎng)的慢速冷凍胚胎。本研究對(duì)深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心2013～2016年慢速冷凍胚胎復(fù)蘇周期進(jìn)行回顧性分析，對(duì)復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植與直接卵裂期移植的臨床結(jié)局進(jìn)行對(duì)比，為臨床選擇移植策略提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2013年1月至2016年12月深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心慢速冷凍胚胎復(fù)蘇周期為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)復(fù)蘇的胚胎為第3天(D3)卵裂期胚胎；(2)同一患者復(fù)蘇的胚胎來(lái)自于同一取卵周期。排除混合移植其他周期胚胎的周期。所有患者在被告知囊胚培養(yǎng)與移植的優(yōu)勢(shì)、風(fēng)險(xiǎn)以及慢速冷凍D3胚胎復(fù)蘇后移植成功率的基礎(chǔ)上，自主選擇復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚再移植或直接行卵裂期胚胎移植，并簽署相應(yīng)的知情同意書(shū)。根據(jù)患者自主選擇的結(jié)果，將研究對(duì)象分為兩組：卵裂期移植組和囊胚移植組。卵裂期移植組即慢速?gòu)?fù)蘇后直接行卵裂期胚胎移植，共55個(gè)復(fù)蘇周期。囊胚移植組即復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚移植，共57個(gè)復(fù)蘇周期。

二、方法

1.慢速冷凍與復(fù)蘇：室溫下胚胎在含20%人血清白蛋白(HSA)(SAGE公司，美國(guó))的改良人輸卵管液(MHTF)(SAGE公司，美國(guó))中沖洗3～5遍，然后依次移至含20%HSA+1.5 M丙二醇、20%HSA+1.5 M丙二醇+0.1 M蔗糖的MHTF中孵育10 min后裝入麥管，再將麥管放入程序冷凍儀(PLANER公司，英國(guó))的支架上。按以下冷凍程序進(jìn)行冷凍：20℃開(kāi)始，以1℃/min降至2℃，停留8 min，以2℃/min降至-7℃，停留10 min，植冰，停留5 min，以0.3℃/min降至-30℃，以10℃/min降至-150℃。復(fù)蘇胚胎時(shí)，在液氮罐中取出麥管，室溫?fù)u晃冷凍麥管40 s；將冷凍麥管放入30℃恒溫水浴箱中，停留20 s；剪斷麥管，將胚胎依次浸入含20%HSA+1.0 M丙二醇+0.2 M蔗糖、20%HSA+0.5 M丙二醇+0.2 M蔗糖、20%HSA+0.2 M蔗糖、20%HSA的MHTF解凍液中各5 min，觀察復(fù)蘇胚胎存活情況，復(fù)蘇后卵裂球存活率≥50%的胚胎定義為存活胚胎。最后將復(fù)蘇后的胚胎移入ART-1029胚胎培養(yǎng)液中(SAGE公司，美國(guó))，待移植或繼續(xù)培養(yǎng)。

2.囊胚培養(yǎng)：復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)采用ART-1029胚胎培養(yǎng)液，培養(yǎng)方式為微滴培養(yǎng)。將復(fù)蘇后的胚胎根據(jù)不同質(zhì)量，每個(gè)微滴1～3枚胚胎，移至提前平衡好的囊胚培養(yǎng)皿中。放置37℃、5%CO2、5%O2的三氣培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48～72 h后觀察囊胚形成情況，并根據(jù)Gardner & Schoolcraft評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)囊胚進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。

3.內(nèi)膜準(zhǔn)備與胚胎移植：對(duì)于月經(jīng)周期正常且排卵規(guī)律的患者采用自然周期方案，即根據(jù)陰道超聲監(jiān)測(cè)，月經(jīng)天數(shù)≥10 d，優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥14 mm，子宮內(nèi)膜達(dá)到7～8 mm以上，排卵后D3進(jìn)行卵裂期胚胎、D5進(jìn)行囊胚移植。月經(jīng)周期不正?；蚺怕巡灰?guī)律的患者采用人工周期方案，即月經(jīng)D3起口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂(lè)，拜耳，德國(guó))4 mg/d×5 d，根據(jù)內(nèi)膜情況調(diào)整劑量及天數(shù)。15 d后B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度7～8 mm以上時(shí)，肌肉注射黃體酮60 mg/d至移植日。B超介導(dǎo)下行胚胎移植術(shù)。

4.觀察指標(biāo)：分析實(shí)驗(yàn)組胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成率，兩組患者復(fù)蘇后第1次移植周期的種植率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率及抱嬰率等臨床結(jié)局。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，率的差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、慢速?gòu)?fù)蘇情況及復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成率

根據(jù)入選時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)，共計(jì)入選112個(gè)慢速?gòu)?fù)蘇周期，復(fù)蘇卵裂期胚胎853枚，復(fù)蘇存活率為72.57%。囊胚移植組共培養(yǎng)囊胚539枚，形成囊胚159枚，囊胚形成率為29.50%，其余未形成囊胚，自然退化或溶解。

二、兩組移植患者基本資料比較

本研究收集的臨床結(jié)局是復(fù)蘇后第1次移植周期的結(jié)局，不考慮重復(fù)周期的情況。其中，卵裂期移植組55個(gè)復(fù)蘇周期中，4個(gè)周期因胚胎溶解取消移植，6個(gè)為重復(fù)周期，剩下第1次移植周期45個(gè)。囊胚移植組57個(gè)復(fù)蘇周期中，1個(gè)周期因胚胎溶解取消繼續(xù)培養(yǎng)，12個(gè)周期無(wú)囊胚形成取消移植，2個(gè)周期因個(gè)人原因取消移植，1個(gè)為重復(fù)周期，剩下第1次移植周期41個(gè)。分析兩組患者基本資料如表1所示。移植時(shí)女方年齡、取卵時(shí)女方年齡、胚胎平均保存時(shí)間、黃體轉(zhuǎn)化日的內(nèi)膜厚度比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

三、兩組移植患者臨床結(jié)局比較

卵裂期移植組移植慢速?gòu)?fù)蘇D3胚胎119枚，其中優(yōu)質(zhì)胚胎比例為58.82%。囊胚移植組移植囊胚57枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚的比例為47.37%。兩組患者移植優(yōu)質(zhì)胚胎的比例無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但是卵裂期移植組的平均移植胚胎數(shù)顯著高于囊胚移植組(P<0.05)。卵裂期移植組的種植率稍低于囊胚移植組，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。卵裂期移植組與囊胚移植組的臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、多胎妊娠率、抱嬰率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表1 兩組患者基本資料比較(-±s)

表2 兩組患者移植臨床結(jié)局比較 [(-±s)，%]

注：*與卵裂期移植組比較，P<0.05；a3個(gè)周期產(chǎn)科結(jié)局失訪；b2個(gè)周期截至投稿日尚未出產(chǎn)科結(jié)局

討 論

近幾年，隨著胚胎培養(yǎng)技術(shù)的提高，囊胚培養(yǎng)與移植逐漸成為輔助生殖技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)，大家逐漸認(rèn)識(shí)到囊胚移植相比卵裂期胚胎移植而言，具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]，包括：(1)對(duì)胚胎做進(jìn)一步篩選和修復(fù)；(2)有機(jī)會(huì)挑選到更具發(fā)育潛力的胚胎用于移植；(3)囊胚期胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更佳，易使胚胎成功種植，并減少移植胚胎數(shù)目，減少多胎的發(fā)生。因此，一部分生殖中心開(kāi)始由卵裂期胚胎移植逐步推向囊胚移植，以期獲得更好的臨床結(jié)局[4-5]。而且，一部分患者也逐漸對(duì)囊胚的優(yōu)勢(shì)有所了解并認(rèn)同，開(kāi)始主動(dòng)選擇囊胚移植，期望獲得更佳的臨床妊娠。早年間慢速冷凍的卵裂期胚胎由于保存時(shí)間長(zhǎng)、母體年齡大等特點(diǎn)，主觀的臨床預(yù)后結(jié)局不佳。而且大部分患者可能保存有超過(guò)3枚的卵裂期胚胎，為了進(jìn)一步篩選有發(fā)育潛能的胚胎移植，提高單次移植的成功率，復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植是最常使用的策略。然而，該策略的有效性尚缺乏相應(yīng)文章的報(bào)道。因此，本研究對(duì)我們中心復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植與直接卵裂期移植的臨床結(jié)局進(jìn)行分析。

本研究納入2013年1月至2016年12月慢速?gòu)?fù)蘇周期112個(gè)，復(fù)蘇D3卵裂期胚胎853枚，復(fù)蘇存活率為72.57%，與已有報(bào)道的慢速解凍復(fù)蘇存活率79.10%[6]相當(dāng)，高于王華等[7]報(bào)道的57.69%，低于張寧媛等[8]報(bào)道的81.25%。產(chǎn)生差異的原因一方面可能是冷凍胚胎的優(yōu)胚比例存在差異，另一方面也可能由于冷凍儲(chǔ)存時(shí)間的不同。我們中心自2010年開(kāi)始逐漸由慢速冷凍向玻璃化冷凍方法過(guò)渡，本研究中的慢速冷凍胚胎的平均儲(chǔ)存時(shí)間超過(guò)7年(表1)。同時(shí)，本研究也驗(yàn)證了慢速?gòu)?fù)蘇存活率遠(yuǎn)低于目前廣泛使用的玻璃化冷凍方法[9]。因此，慢速冷凍復(fù)蘇后，無(wú)可用胚胎、取消移植的比例較高。本研究中卵裂期移植組共有55個(gè)復(fù)蘇周期，4個(gè)周期因胚胎溶解取消移植。囊胚移植組共有57個(gè)復(fù)蘇周期，1個(gè)周期因胚胎溶解取消培養(yǎng)。囊胚移植組培養(yǎng)胚胎539枚，形成159枚囊胚，12個(gè)周期因無(wú)囊胚形成而取消移植，囊胚形成率為29.50%，遠(yuǎn)低于本中心D3新鮮剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚形成率55.13%(2016年數(shù)據(jù)，未發(fā)表)以及報(bào)道的玻璃化D3冷凍胚胎復(fù)蘇后囊胚形成率45.10%[10]和54.7%[11]。但是與唐永梅等[12]2012年報(bào)道的復(fù)蘇胚胎囊胚形成率32.85%相當(dāng)，該研究中僅部分卵裂期胚胎采用慢速冷凍-快速?gòu)?fù)溫法，仍有一部分采用的是玻璃化冷凍解凍法。影響囊胚形成的因素很多，包括培養(yǎng)的卵裂期胚胎的質(zhì)量、患者年齡、體重指數(shù)(BMI)水平、FSH劑量等[13]，這可能也是產(chǎn)生上述差異的原因。

囊胚移植與卵裂期胚胎移植的對(duì)比研究很多[14]，2016年Glujovsky等[15]綜述了27項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)的研究結(jié)果，認(rèn)為新鮮囊胚移植有更高的臨床妊娠率和活嬰出生率。然而，最新一篇Meta分析入選了12項(xiàng)RCT研究總結(jié)提出，囊胚優(yōu)于卵裂期胚胎移植的證據(jù)較弱，尚需要設(shè)計(jì)更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腞CT研究證實(shí)[16]。Carvalho等[17]2016年最新研究結(jié)果又表明，新鮮周期囊胚與卵裂期移植臨床結(jié)局存在差異，而復(fù)蘇周期中并無(wú)這種差異。上述研究表明目前對(duì)于囊胚移植還是卵裂期移植尚存在爭(zhēng)議。在本項(xiàng)研究中我們分析復(fù)蘇后第1次移植周期的結(jié)局，規(guī)避多周期患者因素對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的干擾。觀察發(fā)現(xiàn)患者移植年齡、取卵年齡、胚胎平均保存時(shí)間、黃體轉(zhuǎn)化日的內(nèi)膜厚度方面均無(wú)顯著性差異。由于胚胎屬性的不同，卵裂期胚胎移植1～3枚，囊胚移植1～2枚，因此，卵裂期胚胎移植組的平均移植胚胎數(shù)顯著高于囊胚移植組(P<0.05)。但是兩組移植胚胎中優(yōu)質(zhì)胚胎的比例無(wú)顯著性差異(P>0.05)。此條件下，種植率方面，卵裂期胚胎移植組有低于囊胚移植組的趨勢(shì)，這與報(bào)道的囊胚移植可能具有更高的種植潛能[18]是相符的，但是并未呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，這可能與本研究中卵裂期胚胎移植組優(yōu)質(zhì)胚胎的比例略高于囊胚移植組有關(guān)。妊娠率方面，卵裂期移植組的臨床妊娠率為44.44%，略高于囊胚移植組的39.02%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)蘇后卵裂期移植的臨床妊娠率與王華等[7]報(bào)道的39.19%基本一致。王欽等[10]對(duì)玻璃化冷凍的D3卵裂期胚胎凍融后培養(yǎng)至囊胚移植的分析結(jié)果表明，卵裂期胚胎凍融后培養(yǎng)至囊胚移植可以得到較好的臨床結(jié)果，移植周期臨床妊娠率為71.8%，顯著高于對(duì)照組的43.9%。妊娠率的差異主要可能是由于患者的平均年齡以及移植胚胎數(shù)和胚胎質(zhì)量的不同。另一方面，與王欽等[10]對(duì)玻璃化冷凍胚胎的研究結(jié)果不同，本研究中慢速冷凍胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚，相比直接移植卵裂期胚胎而言，并未見(jiàn)改善臨床結(jié)局。這可能是由于入選人群的差異，本研究中冷凍胚胎復(fù)蘇移植患者年齡偏大，胚胎保存年份較長(zhǎng)，加上慢速冷凍技術(shù)本身的局限性，其預(yù)后結(jié)局可能較差。根據(jù)美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)(ASRM)與美國(guó)輔助生殖技術(shù)協(xié)會(huì)(SART)實(shí)踐委員會(huì)共識(shí)，預(yù)后差的患者囊胚移植并不能改善臨床結(jié)局[19]。因此，權(quán)衡兩種移植策略，囊胚期移植確實(shí)能夠顯著減少平均移植胚胎數(shù)，有降低多胎妊娠的可能[15，20]。但是也增加了無(wú)可移植胚胎的風(fēng)險(xiǎn)，而且囊胚培養(yǎng)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[21]。

綜上，早期慢速冷凍的D3卵裂期胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)至囊胚移植的策略有利有弊，總體而言對(duì)臨床結(jié)局的改善不大。各中心需要綜合考慮患者意愿及具體情況，選擇合適的慢速冷凍胚胎復(fù)蘇后移植策略。

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