神經(jīng)軸突導(dǎo)向生長(zhǎng)因子-1在子宮腺肌病子宮內(nèi)膜肌層交界區(qū)中的表達(dá)及意義研究

江曉紅，鐘少平，車璇，朱偉英，沈春娟，朱巍立

子宮腺肌?。ˋDM）是婦科常見(jiàn)病，以經(jīng)量增多、經(jīng)期延長(zhǎng)及痛經(jīng)為主要臨床表現(xiàn)的一種良性病變；但同時(shí)又具有侵襲、增殖等惡性腫瘤的特征。最近研究表明，子宮內(nèi)膜與肌層交界帶（EMI）的異常改變?cè)谧訉m腺肌病的發(fā)病起著重要作用[1-2]。目前神經(jīng)及血管因素與子宮腺肌病的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)[3]。神經(jīng)軸突導(dǎo)向生長(zhǎng)因子-1（Netrin-1）作為一種引導(dǎo)神經(jīng)軸突定向生長(zhǎng)的血管新生相關(guān)因子，在腦缺血神經(jīng)修復(fù)過(guò)程中，通過(guò)誘導(dǎo)軸突導(dǎo)向性生長(zhǎng)，修復(fù)缺血壞死腦組織；同時(shí)，Netrin-1還通過(guò)血管新生的方式，參與壞死腦組織修復(fù)組織的血供[4-5]。本研究擬通過(guò)檢測(cè)ADM患者Netrin-1在EMI的表達(dá)情況，探討Netrin-1的生理作用及其與ADM發(fā)病的可能關(guān)系?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集2014年1月至2015年8月在浙江省嘉興市婦幼保健院婦科行全子宮切除術(shù)的患者，術(shù)前診斷ADM并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)者15例（除外合并子宮肌瘤）為研究組，年齡40～59歲，中位年齡49歲。另收集本院同期15例子宮肌瘤（除外子宮黏膜下肌瘤）為對(duì)照組，年齡39～58歲，中位年齡47歲，其中增殖期內(nèi)膜11例，分泌期l0例。兩組患者均月經(jīng)周期規(guī)律，年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞ 0.05）；且均除外合并子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜息肉、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)及腎上腺功能亢進(jìn)等疾病，術(shù)前3個(gè)月未使用激素治療及放置宮內(nèi)節(jié)育器者。

1.1.2 標(biāo)本來(lái)源 組織取材及 EMI定位：將術(shù)中切下的子宮腔“Y”字形剖開(kāi)，于子宮體部按組織解剖定位并切取EMI及周圍組織，約lcm×1cm×1cm，將組織標(biāo)本均勻等分分為3份。先將標(biāo)本放在0.9%氯化鈉注射液中過(guò)洗2～3遍，取出標(biāo)本，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗后，一份子宮標(biāo)本置于10%的甲醛中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片后供免疫組化測(cè)定；另兩份子宮組織標(biāo)本置于滅活的凍存管中迅速放置于液氮中保存留著提取RNA及蛋白用。

1.1.3 主要試劑及儀器 鼠抗人CD34單克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），兔抗人netrin-1單克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），SABC免疫組化試劑盒（北京中山生物技術(shù)有限公司），Trizol、 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、Taq、SYBRGreenⅠ熒光染料、SYBRGreenⅠ熒光染料（日本 TOYOBO 公司），Oligo（dT）18及PCR引物購(gòu)置上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Netrin-1引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，上游引物：5’-TGGGGCGGTTGTCCTATTTC-3’， 下游引物：5’-GCCTTGTTGCTTGGCGTGT-3’。Lightcycler熒光PCR擴(kuò)增儀為瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測(cè)Netrin-1的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)方法（SABC法）定位檢測(cè)各組標(biāo)本中Netrin-1蛋白的表達(dá)。具體方法如下：常規(guī)組織切片的制備，采用SABC法行免疫組織化學(xué)分析，其中Netrin-1單克隆抗體工作濃度為1∶100稀釋，采用聯(lián)苯二胺（DAB）顯色（期間在每組切片中任選一張用1×PBS代替一抗，作為陰性對(duì)照，以排除非特異性染色）。采用美國(guó)Pixera公司顯微攝像系統(tǒng)（800萬(wàn)像素），對(duì)所有切片隨機(jī)選取上、下、左、右部及中央部隨機(jī)選取五個(gè)視野。陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為鏡下組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞染色呈棕褐色或者棕黃色沉淀，染色明顯高于背景。

2 結(jié)果

2.1 Netrin-1在子宮組織中的免疫表達(dá)情況 Netrin-1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于增生子宮平滑肌細(xì)胞周圍神經(jīng)纖維，同時(shí)弱表達(dá)于增生血管內(nèi)皮細(xì)胞。EMI在免疫組化染色片子下結(jié)構(gòu)可與外周肌層分辨（圖1）。在子宮肌瘤患者子宮組織 EMI中則未見(jiàn)神經(jīng)纖維表達(dá)。在放大200光鏡視野下，每視野 ADM 纖維數(shù)為（3.81±0.17）個(gè)，而在子宮肌瘤患者中未見(jiàn)神經(jīng)纖維表達(dá)。圖1～3為1例ADM患者病理圖片，其中棕色顆粒著色較深處為Netrin-1強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于周圍神經(jīng)纖維處。圖4～6為1例子宮肌瘤患者病理圖片，其間未見(jiàn)周圍神經(jīng)纖維染色。

2.2 Netrin-1在子宮肌瘤及ADM組織中的表達(dá)情況比較 Netrin-1mRNA在

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用 檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.2 子宮組織中Netrin-1mRNA表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR，檢測(cè)子宮組織中Netrin-1mRNA表達(dá)水平。具體步驟如下：采用Trizol-氯仿-異丙醇一步法提取組織細(xì)胞總 RNA。逆轉(zhuǎn)錄后行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)獲取各組標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算機(jī)分析Ct值。

1.2.3 子宮組織中Netrin-1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)試驗(yàn)過(guò)程 采用蛋白免疫印跡技術(shù)（Western blotting），檢測(cè)子宮組織中Netrin-1蛋白表達(dá)水平。抽提組織總蛋白樣品后，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定，行SDS-PAGE電泳、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)、顯影及定影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。子宮肌瘤及 ADM 組織中表達(dá)情況為（1.00±0.00）及（32.78±3.37），ADM患者Netrin-1mRNA水平高于子宮肌瘤組織（=5.81，＜0.05）。Netrin-1蛋白在子宮肌瘤及 ADM 組織中表達(dá)情況為（1.00±0.00）及（26.57±1.26），ADM 組織中 Netrin-1表達(dá)高于子宮肌瘤組織（=7.17＜ 0.05）。

3 討論

ADM的病因及發(fā)病機(jī)制雖然目前仍然尚不清楚，但EMI結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)內(nèi)膜侵襲和局部新生血管形成及神經(jīng)纖維增生在其發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。既往認(rèn)為，ADM的發(fā)生發(fā)展主要是由子宮內(nèi)膜向子宮肌層內(nèi)生長(zhǎng)所導(dǎo)致，但磁共振影像學(xué)研究表明，子宮內(nèi)膜肌層交界區(qū)結(jié)構(gòu)及功能的破壞，交界區(qū)子宮平滑肌細(xì)胞的增生擴(kuò)散及異常增長(zhǎng)可能優(yōu)先于子宮內(nèi)膜細(xì)胞向肌層增長(zhǎng)[1,6]。EMI的正常結(jié)構(gòu)與功能的維持有賴于甾體激素及其局部多種細(xì)胞因子的嚴(yán)密調(diào)控[7-8]。

新生血管形成是異位子宮內(nèi)膜侵入肌層并生長(zhǎng)的必要條件，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是參與調(diào)控血管生長(zhǎng)的最重要因子，可促進(jìn)有絲分裂和趨化作用，為新生組織細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持。研究發(fā)現(xiàn)VEGF在子宮腺肌病患者交界帶的表達(dá)，提示EMI處表達(dá)強(qiáng)度與遠(yuǎn)肌層比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9-10]。目前神經(jīng)及血管因素與子宮腺肌病的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，處于含Netrin-1的環(huán)境中或分泌Netrin-1的共培養(yǎng)體系時(shí)，脊髓細(xì)胞均可形成條索樣結(jié)構(gòu)。且研究亦證實(shí)脊髓細(xì)胞條索樣生長(zhǎng)長(zhǎng)度與Netrin-1 濃度成正比[11-12]。此外，Netrin-1刺激血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，參與血管新生過(guò)程，并且可能具備較VEGF更強(qiáng)的促血管新生功能[11,13]。

研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜異位癥患者疼痛程度與神經(jīng)纖維分布遠(yuǎn)近有關(guān)，子宮腺肌病患者神經(jīng)纖維的異常植入亦可能是其疼痛的重要機(jī)制之一[14]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)Netrin-1表達(dá)于子宮腺肌病EMI中增生神經(jīng)纖維；而在子宮肌瘤患者中未見(jiàn)異常增生神經(jīng)纖維。筆者亦發(fā)現(xiàn)Netrin-1表達(dá)于子宮腺肌病EMI中血管內(nèi)皮細(xì)胞。這也證實(shí)血管與神經(jīng)二者伴行分布，神經(jīng)纖維支配血管的同時(shí)，血管也在為神經(jīng)的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)的支持。

圖 1ADM（HE 染色，×200）

圖 2ADM（SABC 染色，×200）

圖3 ADM（SABC染色，×400）

圖4 子宮肌瘤（HE染色，×200）

圖5 子宮肌瘤（SABC染色，×200）

圖6 子宮肌瘤（SABC染色，×400）

綜上所述，新生血管的形成和神經(jīng)纖維增生過(guò)程中可能通過(guò)Netrin-1發(fā)生相互協(xié)調(diào)。Netrin-1可促進(jìn)子宮內(nèi)膜-子宮肌層交界面血管新生及神經(jīng)纖維增生，為異位生長(zhǎng)的內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞提供賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)其增殖和浸潤(rùn)入子宮肌層并增大病灶的深度及范圍，加重痛經(jīng)的程度。這提示在臨床上通過(guò)對(duì)ADM患者注射拮抗Netrin-1的物質(zhì)，從而相應(yīng)減少新生血管的形成和神經(jīng)纖維增生過(guò)程，在臨床上相應(yīng)減輕ADM疼痛程度不失為一種可能。

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