納豆激酶分批補料發(fā)酵的研究

吳燕，梁向峰，劉會洲，李英波*，肖建輝

1(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，貴州 遵義，563003) 2(中國科學(xué)院過程工程研究所，中國科學(xué)院綠色過程與工程重點實驗室，北京，100190) 3(中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，中國科學(xué)院生物基材料重點實驗室，山東 青島，266101)

納豆激酶(nattokinase, NK)是一種由納豆枯草桿菌(Bacillussubtilisnatto)分泌的具有強大溶栓活性的絲氨酸蛋白酶[1]。藥理研究表明，該酶可以通過直接溶解纖維蛋白和激活體內(nèi)的纖溶酶原兩種途徑來發(fā)揮其溶栓作用[2-4]。此外，與目前臨床上常用的尿激酶、蚓激酶和纖溶酶原激活劑等溶栓藥物相比，該酶具有可口服、安全、持久和廉價等優(yōu)勢[5]，因此被認(rèn)為是極具開發(fā)潛力的功能性食品和溶栓藥物。

納豆激酶可通過固體發(fā)酵和液體發(fā)酵進行生產(chǎn)。液體發(fā)酵傳質(zhì)均勻，過程易于監(jiān)測、控制和放大，近年來已成為納豆激酶生產(chǎn)的主要手段。目前，國內(nèi)外有關(guān)納豆激酶液體發(fā)酵的研究主要集中在高產(chǎn)菌種的篩選或構(gòu)建，培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化[6-8]。培養(yǎng)基中的碳源和氮源，既是菌體生長的營養(yǎng)物質(zhì)，也是納豆激酶的前體物質(zhì)。適宜的碳源和氮源是促進納豆激酶合成的關(guān)鍵[9]。然而，如果一次性在培養(yǎng)基中添加大量碳源或氮源，可能會導(dǎo)致菌體生長受到抑制，并影響體系的傳質(zhì)和溶氧，使酶產(chǎn)量顯著下降[10]。分批補料發(fā)酵既可保證發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)的供給，又可以有效地消除某些底物對產(chǎn)物合成所產(chǎn)生的阻遏或抑制效應(yīng)[11]。因此，通過分批補料發(fā)酵將有可能緩解此矛盾，從而促進菌體生長和提高納豆激酶的產(chǎn)量。

以枯草芽孢桿菌LSSE-22(BacillussubtilisLSSE-22)為生產(chǎn)菌株，通過考察補料底物、補料方式和補料時間對產(chǎn)酶的影響，建立了搖瓶分批補糖發(fā)酵工藝。在此基礎(chǔ)上，進行了7.5 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵放大研究，以期進一步推動納豆激酶的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

產(chǎn)納豆激酶的枯草芽孢桿菌BacillussubtilisLSSE-22由本實驗室從豆醬制品篩選獲得，菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏編號為：CGMCC No. 4970[12]。

凝血酶、纖維蛋白原，美國Sigma公司；PBS緩沖液，無錫傲銳東源生物科技有限公司；尿激酶，中國食品藥品檢定研究院；瓊脂糖，美國NOVON公司；葡萄糖、MgSO4、NaCl、CaCl2、K2HPO4、蔗糖、苯酚，西隴化工股份有限公司；胰蛋白胨、酵母粉，英國Oxoid公司；瓊脂粉，日本Japan公司；濃H2SO4、氨水、HCl，北京化工廠；大豆蛋白胨、牛肉膏，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甘油，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乳糖、麥芽糖，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；糖蜜，上海正和實業(yè)有限公司。

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.2；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10，大豆蛋白胨30，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.85，NaCl 5，CaCl20.22，pH 7.2。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺，北京市冠鵬凈化設(shè)備有限公司；LDZX-75KBS蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；752s紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；PHSJ-4F pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DHZ-CA恒溫振蕩器, 太倉市實驗設(shè)備廠；HC-2518高速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；5424離心機，德國Eppendorf公司；BIOFLO 3000發(fā)酵罐，美國NBS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

在LB固體培養(yǎng)基平板上挑選較大的單菌落，接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)10 h。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將4 mL種子液轉(zhuǎn)接至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃，200 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)。定時取樣測定菌體量、殘?zhí)橇亢图{豆激酶產(chǎn)量。

1.3.3 碳源及其濃度的影響

分別用20 g/L葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、乳糖和糖蜜為碳源進行發(fā)酵，以生物量和納豆激酶產(chǎn)量為指標(biāo)，確定最優(yōu)碳源，隨后研究最優(yōu)碳源質(zhì)量濃度(5、10、20和30 g/L)對發(fā)酵的影響。每個條件均設(shè)3個重復(fù)。

1.3.4 氮源及其濃度的影響

在確定合適的碳源的基礎(chǔ)上，分別以30 g/L大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉和牛肉膏為氮源進行發(fā)酵，以生物量和納豆激酶產(chǎn)量為指標(biāo)，確定最優(yōu)氮源，并研究最優(yōu)氮源質(zhì)量濃度(10、30、50和70 g/L)對發(fā)酵的影響。每個條件均設(shè)3個重復(fù)。

1.3.5 補料底物的影響

在葡萄糖初始濃度為10 g/L的條件下，當(dāng)發(fā)酵進行24 h(此時葡萄糖濃度消耗至2 g/L以下)，在搖瓶中分別一次性補加如下底物：(1)0.8 mL的0.5 g/mL葡萄糖溶液；(2)0.8 mL的1.5 g/mL大豆蛋白胨溶液；(3)0.86 mL含0.5 g/mL的葡萄糖和1.5 g/mL的大豆蛋白胨的復(fù)合培養(yǎng)液，進行分批補料發(fā)酵。

1.3.6 補料方式的影響

在搖瓶中，用0.5 g/mL的葡萄糖溶液按以下補料方式進行分批補料發(fā)酵：(1)在發(fā)酵進行24 h，一次補加0.5 g/mL的葡萄糖溶液，使葡萄糖質(zhì)量濃度達到5 g/L；(2) 在發(fā)酵進行24 h，一次補加0.5 g/mL的葡萄糖溶液，使葡萄糖質(zhì)量濃度達到10 g/L；(3)分別在第24 h和40 h分兩次補加0.5 g/mL的葡萄糖溶液，每次使培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度保持在5 g/L左右。

1.3.7 補料時間的影響

分別在發(fā)酵時間的第24、32 h開始補加0.5 g/mL的葡萄糖溶液至5 g/L。

1.3.8 7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

在發(fā)酵條件為37 ℃，溶氧20%，通氣量2 vvm，葡萄糖初始質(zhì)量濃度10 g/L的條件下進行培養(yǎng)。裝液量3 L,接種量為240 mL。通過預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)葡萄糖在發(fā)酵罐中比在搖瓶中消耗得快，因此調(diào)整補糖策略，即在發(fā)酵的第12、20 h，由蠕動泵將0.5 g/mL的葡萄糖加入發(fā)酵罐內(nèi)，使葡萄糖質(zhì)量濃度控制在5 g/L左右。在其他條件相同的情況下，以不補加葡萄糖發(fā)酵作為對照組。每隔4 h取樣，檢測發(fā)酵液中菌體生物量和納豆激酶酶活性。

1.3.9 細(xì)胞干重的測定

空離心管85 ℃烘干2 h稱重，取混合均勻的發(fā)酵液50 mL移至離心管中。10 000 r/min離心5 min，棄上清。重復(fù)上述步驟2次，棄上清，在85 ℃烘箱烘干24 h后稱重。

1.3.10 殘?zhí)堑臏y定

采用濃硫酸-苯酚法[13]測定培養(yǎng)基中殘?zhí)菨舛取?/p>

制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。配置100 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按比例稀釋至20、40、60、80、100 mg/L。分別取1 mL于試管中，加入9%的苯酚溶液0.5 mL，充分混勻。迅速加入2.5 mL濃硫酸混勻。待冷卻至室溫后，在485 nm處測定吸光值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取-20 ℃保存的發(fā)酵液，10 000 r/min離心5 min，取上清，根據(jù)濃度變化稀釋10～60倍，再以同樣的條件進行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算殘?zhí)菨舛取?/p>

1.3.11 納豆激酶活性的檢測

采用纖維蛋白平板法[14]測定納豆激酶活性。

配置纖維蛋白平板：稱60 mg纖維蛋白原，溶解于10 mL PBS溶液中。另稱取0.1 g瓊脂糖，加入10 mL PBS溶液，加熱至完全溶解。待瓊脂糖溶液溫度冷卻至40 ℃左右，在纖維蛋白原溶液中加入750 μL凝血酶混勻，然后迅速將兩種溶液混合，倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固制成平板。室溫放置1 h后，用孔徑為0.3 cm的打孔器打孔。

用PBS緩沖液配置尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并分別稀釋成500、400、300、200、100 IU/mL的濃度梯度，然后各取10 μL注入纖維蛋白平板的孔中，37 ℃恒溫孵育18 h后測量其透明圈兩條相互垂直的直徑，并計算其面積。以尿激酶活力為橫坐標(biāo)，透明圈面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

培養(yǎng)結(jié)束后的發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取上清。將納豆激酶樣品點于平板上，37 ℃恒溫孵育18 h，測其溶解圈直徑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以尿激酶活力單位表示其纖溶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源及其質(zhì)量濃度對細(xì)胞生長和納豆激酶產(chǎn)量的影響

為選擇適宜的發(fā)酵碳源，分別考察葡萄糖、蔗糖、甘油、乳糖、麥芽糖、糖蜜對菌體生長和納豆激酶產(chǎn)量的影響，濃度為20 g/L，結(jié)果見表1。表1表明以葡萄糖作為碳源，菌體量和酶產(chǎn)量均為最高，分別達到1.79 g/L和1 029 IU/mL，其次為麥芽糖和蔗糖。朱健輝等[15]研究發(fā)現(xiàn)麥芽糖是合成納豆激酶的最適碳源，而BERENJIA等[7]的研究表明，最適碳源為甘油，均與本研究結(jié)果不同。這可能與不同產(chǎn)酶菌株對碳源的偏好不同有關(guān)。綜上，確定葡萄糖為納豆激酶發(fā)酵的碳源。

表1 不同碳源對枯草芽孢桿菌細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響

為選擇適宜的初始碳源質(zhì)量濃度，進一步考察葡萄糖質(zhì)量濃度為5、10、20、30 g/L時菌體生長和產(chǎn)酶情況(圖1)。結(jié)果表明，在5～20 g/L質(zhì)量濃度的范圍內(nèi)，菌體量和酶產(chǎn)量均隨葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而增加。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為10和20 g/L時，菌體量和酶產(chǎn)量變化不大，且兩者在發(fā)酵48 h時達到最大值，分別為1.75 g/L和1 014.22 IU/mL。當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量濃度增加至30 g/L，細(xì)胞生長和酶產(chǎn)量均受到嚴(yán)重的抑制。此外，在所試驗的糖濃度下，酶的合成過程和菌體的生長是一致的，表明產(chǎn)物的形成和菌體的生長具有緊密的關(guān)聯(lián)性。在初始糖質(zhì)量濃度大于20 g/L的條件下，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液愈加黏稠，營養(yǎng)物質(zhì)的運輸和氧的分布均受到影響，造成碳源的利用不充分，酶產(chǎn)量增長有限。故選擇10 g/L為發(fā)酵初始濃度。

圖1 葡萄糖質(zhì)量濃度對細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of glucose concentration on cell growth and NK production

2.2 氮源及其質(zhì)量濃度對細(xì)胞生長和納豆激酶產(chǎn)量的影響

在質(zhì)量濃度為30 g/L的條件下，考察了大豆蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏對細(xì)胞生長和酶產(chǎn)量的影響。從表2可以看出，當(dāng)?shù)礊榇蠖沟鞍纂藭r，菌體量和酶產(chǎn)量均為最高，分別為1.94 g/L和1 107.00 IU/mL。其次為酵母粉和牛肉膏。胰蛋白胨的效果最差，用其為氮源所獲得的酶產(chǎn)量僅為大豆蛋白胨的1/2。這與謝秋玲[10]和LIU[9]等人的研究結(jié)果一致。目前，大豆蛋白胨促進納豆激酶合成的機理尚不清楚，前人通過實驗推測納豆激酶產(chǎn)量的提高是由于大豆蛋白胨中某種獨特小分子物質(zhì)發(fā)揮的誘導(dǎo)作用[10]，然而，對于該誘導(dǎo)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的確定需要進一步深入研究。

進一步研究大豆蛋白胨初始濃度的影響。由圖2-A可以看出，菌體量隨著大豆蛋白胨質(zhì)量濃度的增加而增加，且在質(zhì)量濃度為50 g/L時菌體量達到最大值。當(dāng)大豆蛋白胨質(zhì)量濃度達到70 g/L時，細(xì)胞的生長受到嚴(yán)重抑制。酶產(chǎn)量在大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為30和50 g/L時相差不大，最高產(chǎn)量為1 210.87 IU/mL。但在質(zhì)量濃度為70 g/L的條件下，酶的合成也受到顯著的抑制。由此可見，氮源質(zhì)量濃度過低，不能滿足菌體生長的需求，菌體生長緩慢，不利于納豆激酶的合成；氮源質(zhì)量濃度過高，則可能會引起培養(yǎng)基滲透壓的升高，菌體量下降，酶產(chǎn)量也隨之下降。因此，選擇氮源的初始濃度為30 g/L。

表2 不同氮源對枯草芽孢桿菌細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響

圖2 大豆蛋白胨質(zhì)量濃度對細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on cell growth and NK production

2.3 搖瓶分批補料發(fā)酵

以上研究結(jié)果表明納豆激酶的合成屬于生長關(guān)聯(lián)型。因此，可以通過促進細(xì)胞的生長來實現(xiàn)酶產(chǎn)量的提高。菌體的生長和營養(yǎng)的供給緊密相關(guān)，過高或過低的底物濃度均不利細(xì)胞生長。為此，以下實驗研究了分批補料發(fā)酵對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。

2.3.1 補料底物對納豆激酶發(fā)酵過程的影響

補料底物對細(xì)胞生長和酶產(chǎn)量的影響如圖3所示。由圖3可知，所有補料底物均能夠不同程度地提高菌體量和酶產(chǎn)量。其中，當(dāng)補加底物為葡萄糖時，細(xì)胞量和酶產(chǎn)量的增長最為顯著。最高酶產(chǎn)量達到1 376.07 IU/mL，比分批培養(yǎng)提高了16.21%。補加復(fù)合底物也可以明顯提高酶產(chǎn)量，但略低于補加葡萄糖組。補加氮源和補加復(fù)合底物的情況相差不大，但與CHO等人報道的補加氮源能夠?qū)⒚府a(chǎn)量提高2.5倍的結(jié)果不同[16]。究其原因，一方面可能是由于本研究中所用發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源是相對充足的；另一方面可能由于本研究所用菌株與文獻中所用的菌株存在差異，氮源對本研究中納豆激酶的合成并不是關(guān)鍵因素。此外，糖的消耗在補加葡萄糖時明顯快于補加復(fù)合底物(圖3-C)，這和細(xì)胞的生長情況吻合良好。由此可見，補加葡萄糖是一種提高納豆激酶產(chǎn)量的有效策略。

圖3 補料底物對細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fed-batch substrate on cell growth and NK production

2.3.2 補料方式對納豆激酶發(fā)酵過程的影響

進一步考察葡萄糖的補料方式對納豆激酶發(fā)酵過程的影響。圖4表明，采用一次少量的補加葡萄糖更利于細(xì)胞的生長和納豆激酶的合成。在一次補糖至5 g/L的條件下，最高酶產(chǎn)量可達到1 437.34 IU/mL，比分批培養(yǎng)提高了21.38%。一次補糖至10 g/L和分兩次補加的方式雖然也可以促進細(xì)胞生長和納豆激酶的合成，但不及一次補糖至5 g/L的方式好。這表明補加少量的葡萄糖對于菌體的生長和酶合成已經(jīng)足夠，而一次性補加過多的葡萄糖則可能會引起糖的抑制效應(yīng)。

圖4 補料方式對細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of fed-batch method on cell growth and NK production

2.3.3 補料時間對納豆激酶發(fā)酵過程的影響

根據(jù)糖的消耗情況，分別在24 h和32 h進行補加葡萄糖。由圖5可以看出，菌體在發(fā)酵的前24 h處于對數(shù)生長期，生長代謝活動較強，葡萄糖消耗迅速。在發(fā)酵前16 h，葡萄糖質(zhì)量濃度仍然較高，過早補充碳源可能會抑制菌體生長。當(dāng)發(fā)酵進行至24 h時，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度已低于2 g/L。在此時間點補加葡萄糖后，菌體量和酶產(chǎn)量均比對照組有顯著的提高(圖5-A)，最高酶產(chǎn)量為1 429.85 IU/mL。而在第32 h(此時殘?zhí)琴|(zhì)量濃度低于1 g/L)進行補糖，菌體量和酶產(chǎn)量沒有明顯變化。分析其原因，可能是枯草芽孢桿菌在第32 h時已進入穩(wěn)定期，其對糖的代謝利用能力有所下降。因此，選擇在第24 h進行補糖較為合適。

圖5 補糖時間對細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fed-batch time on cell growth and NK production

2.4 7.5 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵與分批補料發(fā)酵結(jié)果比較

為進一步驗證補糖策略的可行性，在7.5 L發(fā)酵罐中進行了放大培養(yǎng)實驗。通過圖5和圖6的對比可以看出，無論是分批發(fā)酵還是分批補料發(fā)酵，發(fā)酵罐中的菌體量、酶產(chǎn)量、生長速率和產(chǎn)酶速率均比搖瓶顯著提高。相應(yīng)地，發(fā)酵罐中糖的消耗速率也明顯提高。例如，在搖瓶中，當(dāng)發(fā)酵進行16 h時，葡萄糖才幾乎被消耗50%，而在發(fā)酵罐中，在同樣的時間點，葡萄糖幾乎被消耗殆盡。究其原因，可能是發(fā)酵罐一直保持比較合適的溶氧水平，促進了菌體對糖的利用。這和前人的研究結(jié)果一致[16]。

從圖6-A還可以看出，通過補糖，不但延長了枯草芽孢桿菌的對數(shù)生長期，而且顯著提高了菌體量。菌體量在第32 h達到 3.09 g/L，比對照組提高了19.2%。酶產(chǎn)量在28 h達到最高值(圖6-B)，為2 046.47 IU/mL，比分批培養(yǎng)納豆激酶的產(chǎn)量提高了29.77%。這些結(jié)果進一步表明，分批補糖發(fā)酵是提高酶產(chǎn)量的有效方法。

圖6 葡萄糖分批補料培養(yǎng)對細(xì)胞生長和NK產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of glucose fed-batch on cell growth and NK production

3 結(jié)論

本研究通過考察不同碳源和氮源對納豆激酶發(fā)酵的影響，得到適合納豆激酶生產(chǎn)的碳源和氮源分別為10 g/L葡萄糖和30 g/L大豆蛋白胨。進一步通過分批補糖策略，納豆激酶在搖瓶中的最高產(chǎn)量達到1 437.34 IU/mL，比分批培養(yǎng)提高了21.38%。最后，將該策略在7.5 L發(fā)酵罐中進行放大實驗，獲得最高的納豆激酶產(chǎn)量為2 046.47 IU/mL，比分批培養(yǎng)提高了29.77%，驗證了補糖策略是一種實現(xiàn)納豆激酶高產(chǎn)的有效方法。研究結(jié)果表明，該策略具有一定的可行性和可操作性，可為納豆激酶的放大生產(chǎn)和應(yīng)用提供良好的借鑒作用。

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