加熱處理對(duì)大果山楂果肉褐變的影響

張巧，陳振林，潘中田，劉艷，段振華*

1(賀州學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，廣西 賀州，542899) 2(賀州學(xué)院 食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州，542899)

大果山楂由小果南山楂經(jīng)過選育嫁接而成，是我國(guó)特有的藥果兼用樹種，在廣西地區(qū)多有種植。與普通山楂相比，大果山楂果粒大，最大可達(dá)300 g左右；總酚、黃酮含量?jī)?yōu)于小果山楂，營(yíng)養(yǎng)豐富；果皮為青色，果肉白色，水分足，口感較好[1-2]。大果山楂含有黃酮和花青苷兩大類酚類物質(zhì)，具有降血脂、降血糖、抑菌、抗腫瘤、防治心血管疾病的功效[3-5]。

本研究從酶促褐變、美拉德反應(yīng)和抗壞血酸氧化反應(yīng)3個(gè)方面考察了大果山楂的褐變機(jī)理，為抑制大果山楂的褐變提供理論依據(jù)，進(jìn)而提高山楂的加工品質(zhì)及儲(chǔ)運(yùn)性能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂，從賀州市水果店購(gòu)買；聚乙烯吡咯烷酮：分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；福林酚試劑：分析純，北京索萊寶科技有限公司；愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、抗壞血酸、3,5-二硝基水楊酸、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722N分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大果山楂加熱處理

選取新鮮山楂一個(gè)，清洗干凈，去核，均勻切塊，每塊質(zhì)量約5 g，分別在煮沸的去離子水中加熱0、0.5、1、1.5、2 min，立即置于冰水中冷卻。

1.3.2 山楂褐變度的測(cè)定[6]

將加熱后的山楂塊分別研磨均勻，4 000 r/min離心20 min，取上清1.0 mL，加1.0 mL的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，搖勻，420 nm處比色。

1.3.3 山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的測(cè)定

取加熱處理后的山楂2 g，加入8 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L、pH 6.5、1%的聚乙烯聚吡咯烷酮)，冰水中研磨成漿，4 ℃下避光浸提2 h，離心，上清液測(cè)定酶活。

多酚氧化酶活性的測(cè)定采用鄰苯二酚法[4]。反應(yīng)體系為磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 6.5)0.5 mL，0.1 mol/L鄰苯二酚1.5 mL，酶液0.15 mL，420 nm處比色，以每分鐘OD值變化0.01作為1個(gè)酶活力單位。

過氧化物酶活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚[5]。反應(yīng)體系為0.05 mol/L的愈創(chuàng)木酚1.5 mL，2%的H2O20.5 mL，酶液0.5 ml，470 nm處比色，以每分鐘OD值變化0.01作為1個(gè)酶活力單位。

1.3.4 山楂總酚、黃酮含量的測(cè)定

取加熱后的山楂2 g，加入8 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液進(jìn)行研磨，室溫下提取20 min，4 000 r/min離心10 min，將分離后的沉淀重復(fù)上述提取過程1次，合并上清液，測(cè)定總酚、黃酮含量。

總酚含量的測(cè)定采用福林試劑法[6]。在離心管中分別加入一定量的樣品溶液，加水補(bǔ)足至4.0 mL后搖勻。然后依次加入福林酚試劑0.25 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%Na2CO3溶液0.75 mL。75 ℃保溫15 min，760 nm處比色。

黃酮含量的測(cè)定參照李維莉等方法[7]。吸取一定量的樣品溶液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液0.3 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的Al(NO3)30.3 mL，6 min后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液4 mL，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液補(bǔ)充至10 mL，靜置15 min，510 nm處比色。

1.3.5 山楂花青苷含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8-9]并稍作修改。加熱后的山楂2 g，用6 mL的酸性乙醇[V(體積分?jǐn)?shù)80%乙醇)∶V(1.25 mol/L HCL)=85∶15]60 ℃避光浸提3 h，535 nm處比色。

1.3.6 山楂抗壞血酸含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]并稍作修改。加熱2 min的山楂塊2 g，分別在空氣中放置0、3、6、12、18 h，加入4 mL的體積分?jǐn)?shù)1%HCl，研磨均勻，離心，取上清液測(cè)定抗壞血酸含量。

在試管中加入一定量的樣品溶液，再加入50mmol/L的FeCl3120 μL，5 mmol/L的K3Fe(CN)60.5 mL，補(bǔ)水至5 mL，40 ℃反應(yīng)12 min，698 nm處比色。

1.3.7 山楂還原糖含量的測(cè)定

采用3,5-二硝基水楊酸法[11]。加熱后的山楂2 g，加6 mL的去離子水，50 ℃浸提15 min，離心，取上清液測(cè)定還原糖含量。

在1 mL的稀釋上清液，加1 mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水中準(zhǔn)確加熱5 min，流水冷卻后補(bǔ)水至10 mL，540 nm處比色。

1 結(jié)果與分析

1.2.1 加熱時(shí)間對(duì)山楂褐變度的影響

褐變度是最能直接反映大果山楂果肉褐變程度的指標(biāo)。將山楂在沸水中加熱0、0.5、1、1.5和2 min，山楂果肉的褐變度如圖1所示。未經(jīng)沸水加熱的山楂塊，研磨后的褐變度吸光值達(dá)到0.727，褐變非常嚴(yán)重。隨著沸水加熱時(shí)間的增加，山楂褐變度明顯降低，且褐變度下降速率是先快后慢。這是由于沸水加熱能有效降低山楂果肉中與褐變相關(guān)酶的活力，從而對(duì)山楂褐變有一定的抑制作用。在一定時(shí)間范圍內(nèi)，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，酶促褐變程度越低。因而，在食品工業(yè)生產(chǎn)中，加熱和燙漂是抑制酶促褐變的常用方法[12]。

圖1 不同加熱時(shí)間對(duì)山楂褐變度的影響Fig.1 Effect of heating time on browning degree of Malus domeri (Bois) Chev.

1.2.2 加熱時(shí)間對(duì)山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的影響

果蔬酶促褐變與多酚氧化酶、過氧化物酶活力密切相關(guān)[14]。在沸水中加熱不同時(shí)間，山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的變化情況如圖2所示。

圖2 不同加熱時(shí)間對(duì)山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性的影響Fig.2 Effect of heating time on polyphenol oxidase and peroxidase activity of Malus domeri (Bois) Chev.

隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性明顯降低，且山楂過氧化物酶比多酚氧化酶活性下降得更快，沸水加熱1.5 min，過氧化物酶完全失活，加熱2 min，多酚氧化酶也幾乎完全失活。山楂多酚氧化酶、過氧化物酶的活性與山楂褐變度呈正相關(guān)關(guān)系。加熱時(shí)間越長(zhǎng)，酶活性越低，山楂褐變程度也越低。由于沸水加熱對(duì)山楂營(yíng)養(yǎng)成分有一定的損失，且容易造成山楂的失重[15]，考慮2 min作為大果山楂的滅酶時(shí)間。

1.2.3 加熱時(shí)間對(duì)山楂總酚、黃酮及花青苷含量的影響

黃酮和花青苷是山楂中最具代表性的酚類物質(zhì)。當(dāng)山楂被切開后，果肉與空氣接觸，山楂中的酚類物質(zhì)在酶的作用下氧化成醌，進(jìn)而聚合形成褐色素，因而酚類物質(zhì)是酶促褐變反應(yīng)的作用底物[16-17]。山楂在沸水中加熱不同時(shí)間，總酚和黃酮及花青苷含量的變化如圖3所示。

圖3 不同加熱時(shí)間對(duì)山楂總酚、黃酮及花青苷含量的影響Fig.3 Effect of heating time on phenols, flavone and anthocyanin content of Malus domeri (Bois) Chev.

由圖3-(a)可知，沸水加熱時(shí)間越長(zhǎng)，總酚含量明顯越多，總酚含量與山楂褐變度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。原因在于未經(jīng)加熱處理的山楂塊，短時(shí)間內(nèi)的褐變使得山楂總酚含量迅速下降，因而總酚含量較低；而經(jīng)沸水加熱一定時(shí)間的山楂塊，山楂中的酚酶活性降低，酶促褐變反應(yīng)受到一定的抑制，總酚含量反而較高。此外，山楂黃酮含量的變化趨勢(shì)與總酚相似，隨著加熱時(shí)間的增加，黃酮含量越多，原因很可能是山楂中的酚酶主要作用于黃酮類物質(zhì)，從而進(jìn)行酶促反應(yīng)，因而加熱時(shí)間增加，酚酶活力減弱，黃酮參與的酶促褐變受到抑制，黃酮化合物含量較多。與此同時(shí)，隨著沸水加熱時(shí)間的增加，山楂花青苷含量的變化如圖3-(b)所示。與未加熱處理的山楂相比，加熱山楂的花青苷含量有少量的降低。原因很可能是煮沸能增加山楂色素的溶解度，因而隨煮沸時(shí)間的增長(zhǎng)，山楂中的花青苷含量稍微減少。

1.2.4 滅酶后山楂褐變度的變化

根據(jù)1.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將切塊后的山楂在沸水中加熱2 min后，山楂多酚氧化酶、過氧化物酶失去活性。滅酶后的山楂塊在室溫存放過程中的褐變度變化情況如圖4所示。

圖4 加熱后山楂在不同保存時(shí)間下的褐變度變化Fig.4 Browning degree in Malus domeri (Bois) Chev. of enzyme inactivation with different storage time

山楂塊分別存放0、3、6、12、18 h，褐變度吸光值變化不顯著。經(jīng)過加熱滅酶處理后，酶促褐變反應(yīng)受到完全抑制，此時(shí)山楂塊的褐變度不隨時(shí)間發(fā)生變化，間接說明山楂快幾乎不發(fā)生非酶促褐變。

1.2.5 滅酶后山楂抗壞血酸和還原糖含量的變化

將山楂塊在沸水中加熱2 min后存放，此時(shí)酶促褐變完全受到抑制。山楂中的抗壞血酸、還原糖含量變化情況如圖5所示。

圖5 加熱后山楂保存不同時(shí)間下的抗壞血酸、還原糖含量的變化Fig.5 Ascorbic acid and reducing sugars content in Malus domeri (Bois) Chev. of enzyme inactivation with different storage time

山楂塊分別存放0、3、6、12、18 h，山楂中的抗壞血酸、還原糖含量不發(fā)生顯著變化，這與1.2.4山楂褐變度的變化結(jié)果一致，說明大果山楂經(jīng)滅酶后在保存過程中幾乎不發(fā)生抗壞血酸氧化反應(yīng)和美拉德反應(yīng)，進(jìn)一步說明大果山楂的褐變與非酶促褐變無關(guān)。

2 結(jié)論

在一定時(shí)間范圍內(nèi)，沸水加熱時(shí)間越長(zhǎng)，大果山楂果肉的褐變度越低。究其原因，是由于加熱導(dǎo)致山楂多酚氧化酶、過氧化物酶活性降低，從而抑制了酶促褐變反應(yīng)。加熱時(shí)間增長(zhǎng)，山楂褐變程度降低，總酚、黃酮含量較未加熱山楂高，花青甘含量有少量的減少。將山楂塊沸水加熱2 min，多酚氧化酶、過氧化物酶基本失去活性，滅酶后山楂塊在存放過程中的褐變度、抗壞血酸和還原糖含量不發(fā)生顯著變化?？梢缘贸鼋Y(jié)論：大果山楂果肉的褐變是由酶促褐變引起的，與非酶促褐變無關(guān)。因此，在今后對(duì)大果山楂果肉進(jìn)行褐變抑制研究時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)考慮在不損失山楂營(yíng)養(yǎng)成分的前提下抑制酶活性，從而為解決大果山楂果肉嚴(yán)重褐變這一難題提供一定的參考依據(jù)。

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