趙蕾,胡文忠*,劉文玲,陳晨,姜愛麗,劉程惠
1(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連,116600) 2(生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連,116600)
胡蘿卜營(yíng)養(yǎng)豐富,含有大量的維生素、蛋白質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)等人體所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),所以有“土人參”,“金筍”之美稱[1-3]。鮮切果蔬是以新鮮果蔬為原料,經(jīng)清洗、去皮、切割等工序而制成的新鮮果蔬產(chǎn)品,鮮切果蔬也被叫作微加工果蔬、輕度加工果蔬或半加工果蔬,具有天然、新鮮、衛(wèi)生、方便等優(yōu)點(diǎn)[4-6]。但是鮮切果蔬在切割過程中會(huì)受到機(jī)械損傷并導(dǎo)致一系列不良的生理生化變化,嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)[7]。NO是近年來發(fā)現(xiàn)的一種小分子信號(hào)物質(zhì),在植物體內(nèi)作為一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子調(diào)控基因的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)植物對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)控[8]?,F(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)證明,NO處理可有效抑制鮮切番茄中乙烯的生物合成和蘋果的乙醇脫氫酶活性,進(jìn)而改善產(chǎn)品感官質(zhì)量、延長(zhǎng)貯藏期;NO處理可通過減少過氧化氫含量積累來延遲新鮮生菜的衰老,降低了鮮切桃片的膜滲透性,保護(hù)了細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu);NO處理降低了竹筍中的活性氧代謝、抑制了丙二醛含量積累,延遲了脂質(zhì)過氧化發(fā)生進(jìn)程[9-13]。本實(shí)驗(yàn)以硝普鈉為NO供體,研究了其對(duì)鮮切胡蘿卜生理生化變化的影響,旨在為鮮切胡蘿卜的傷害生理和貨架期延長(zhǎng)奠定理論基礎(chǔ)。
胡蘿卜,購(gòu)于大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)樂購(gòu)超市;硝普鈉(SNP,分析純),購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。
體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2、Na2HPO4、NaH2PO4、硼砂、甲醇、L-苯丙氨酸、抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮、亞油酸鈉、三聚乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、無水乙醇、丙酮、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、濃HCl(以上試劑均為分析純),購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心;乙二胺四乙酸(EDTA,生化試劑)、H3BO3(分析純),購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
電熱恒溫水浴鍋(DK-S26),上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電子分析天平(AL240),Mettler-Toledo instr:Ltd,紫外可見分光光度計(jì)(UV-9200),北京瑞利分析儀器有限公司;勻漿機(jī)(T-25),德國(guó)IKA;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG39053A),上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(BR4i),法國(guó)Jouan;冰箱(BCD-257DVC),青島海爾股份有限公司;制冰機(jī)(SiM-F140),日本三洋。
挑選大小和成熟度基本一致、無機(jī)械傷、病蟲害的胡蘿卜。切割前用自來水沖洗、風(fēng)干(無需去皮)。用消毒的不銹鋼刀將胡蘿卜切割成2~3 mm厚片狀,將切割好的胡蘿卜片于0.1 mmol/L硝普鈉(NO供體)溶液中浸泡2 h,取蒸餾水浸泡作為對(duì)照。將處理完的樣品取出后,均勻放到一次性托盤中,每盤10片,每片約為3.5 g;并將托盤放到無菌操作臺(tái)中送風(fēng)處理1 min,取出后用保鮮膜包好,置于濕度85%~90%,4 ℃冷庫(kù)中貯藏。分別取0、2、4、6、8、10、13、15 d,每個(gè)處理樣各取3盤進(jìn)行胡蘿卜的感官品質(zhì)和生理生化指標(biāo)的測(cè)定,每項(xiàng)指標(biāo)重復(fù)3次。
1.4.1 白度值的測(cè)定
白度值的測(cè)定參考LAVELLI[14]等方法,運(yùn)用參數(shù)L*,a*和b*。其中L*為明亮度,a*為綠/紅指數(shù),b*為藍(lán)/黃指數(shù)。按公式(1)計(jì)算:
WI=100-[(100-L*)2+a*+b*]1/2
1.4.2 酶活性的測(cè)定
酶提取液的制備:取5 g樣品,加0.1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)于20 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的0.2 mol/L磷酸提取緩沖液(pH=6.4)中,冰浴研磨勻漿,并于4℃、12 000 r/min離心30 min,取上清液為酶的粗提液,供PPO、POD、PAL共用,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
PPO、POD活性的測(cè)定參考CHEN[15]等稍作修改。PPO活性:將0.5 mL粗酶提取液加入3 mL 0.5 mol/L的鄰苯二酚溶液中,加蓋迅速混勻后,掃描并記錄30 s內(nèi)398 nm處吸光值變化。POD活性:取2mL 0.05%愈創(chuàng)木酚溶液于小試管中加入0.5 mL酶液混勻后置于30 ℃水浴鍋中保溫5 min,然后加入1 mL 0.08% H2O2溶液后掃描1 min內(nèi)460 nm處吸光值變化。
PAL活性的測(cè)定參照馬躍[16]等方法。取1支試管,加入3 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液,在37 ℃預(yù)保溫10 min,再加入0.5 mL酶液,混合后,迅速測(cè)定該混合液在290 nm處的吸光值作為反應(yīng)的初始值(OD0)。然后將反應(yīng)管置于37 ℃保溫60 min。保溫結(jié)束時(shí),再立即測(cè)定反應(yīng)混合液在290 nm處的吸光值作為反應(yīng)的終止值(OD1)。根據(jù)保溫前后樣品管溶液吸光值的變化計(jì)算PAL活性。
CAT、LOX、APX活性的測(cè)定參照閆媛媛[17]等方法。CAT活性:酶提取液同上。取3 mL 20 mmol/L H2O2和0.5 mL酶提取液于比色皿中快速搖勻立即掃描混合液在240 nm處3 min內(nèi)的吸光值,蒸餾水進(jìn)行調(diào)零。
LOX活性:2.7 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH=6.4)中加入0.2 mL 0.5%的亞油酸鈉溶液,然后加入0.1 mL酶液,5 s后掃描混合物在234 nm下吸光值的變化。
APX活性:向試管中加入2.6 mL反應(yīng)緩沖液和0.1 mL酶提取液,最后加入0.3 mL 2 mmol/L H2O2啟動(dòng)酶促反應(yīng)。振蕩混勻后測(cè)定30 s內(nèi)反應(yīng)體系在290 nm的吸度值。
1.4.3 其他指標(biāo)的測(cè)定
總酚含量的測(cè)定采用福林酚法[18],5 g樣品加20 mL甲醇溶液冰浴勻漿,并于4 ℃、12 000 r/min離心30 min,取上清液于25 mL容量瓶中,加入1 mL福林酚溶液后振蕩混勻,再加入10 mL 7% Na2CO3溶液,最后定容至刻度。室溫放置90 min后,測(cè)定其在750 nm處的吸光值,結(jié)果用mg/g表示。
類黃酮含量的測(cè)定采用HCL-甲醇法[18],向裝有10 g鮮切胡蘿卜的研缽中加入少許預(yù)冷的1% HCl-甲醇溶液,在冰浴條件下研磨勻漿后,轉(zhuǎn)入20 mL刻度試管中。用1% HCl-甲醇溶液漂洗,漂洗后一并轉(zhuǎn)移到試管中,定容至20 mL混勻,于4 ℃避光條件下提取20 min,期間數(shù)次搖晃過濾,收集濾液待用。以1% HCl-甲醇溶液做空白進(jìn)行調(diào)零,取濾液于325 nm測(cè)定溶液的吸光度值。
電導(dǎo)率的測(cè)定參照張向陽[19]等方法稍作修改,胡蘿卜經(jīng)切分后,用打孔器切取大小一致的薄片15個(gè)。蒸餾水清洗2次置于三角瓶中,加蒸餾水150 mL,立即測(cè)電導(dǎo)率P0,放置20 min后測(cè)電導(dǎo)率P1,然后煮沸10 min,冷卻至室溫,加水至原始刻度,平衡10 min測(cè)其電導(dǎo)率P2。
丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[19],稱取5 g樣品加入10mL TCA溶液冰浴研磨勻漿,并于4 ℃、12 000 r/min離心20 min,取上清液為酶的粗提液,低溫保存?zhèn)溆?。? mL酶提取液和2 mL含0.5%TBA的TCA溶液混勻。熱水加熱15 min后,迅速取出并用冰水冷卻,然后分別測(cè)定在532 nm和600 nm處吸光值。
上述實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行重復(fù),用Excel計(jì)算數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差和均值,用SPSS數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行顯著性分析。
胡蘿卜經(jīng)鮮切處理后主要顏色變化就是發(fā)生白變。鮮切胡蘿卜發(fā)生白變現(xiàn)象主要是因?yàn)橐韵聝煞矫妫?1)胡蘿卜經(jīng)去皮、切割處理導(dǎo)致表面細(xì)胞受損發(fā)生脫水干燥現(xiàn)象使表面顏色變淡;(2)經(jīng)切割處理后使大部分細(xì)胞破裂,進(jìn)而加速了合成木質(zhì)素的酶促過程,在破損表面形成白色物質(zhì)(木質(zhì)素)[20]。反映胡蘿卜顏色變化的主要指標(biāo)為白度值(WI),貯藏期間該指標(biāo)的變化如圖1所示,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),2組白度值均呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢(shì)。經(jīng)NO處理過的鮮切胡蘿卜白度值顯著低于空白組(p<0.05),這說明NO處理能有效減少胡蘿卜表面脫水和木質(zhì)素的合成進(jìn)而減緩胡蘿卜白化進(jìn)程。
圖1 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜白度值的影響Fig.1 Effect of NO treatment on whiteness of fresh-cut carrots
果蔬的衰老主要是因?yàn)榛钚匝醯姆e累,受到切割后活性氧的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞,果蔬衰老加劇[18]。CAT和APX都能分解果蔬代謝產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)進(jìn)而有效地清除自由基。如圖2所示。
圖2 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜過氧化氫酶活性的影響Fig.2 Effect of NO treatment on the activity of catalase in fresh-cut carrots
在整個(gè)貯藏期內(nèi)CAT活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),經(jīng)NO處理過的胡蘿卜其CAT活性顯著高于空白組(p<0.05)且后期下降速率慢。這說明經(jīng)NO處理能有效提高CAT活性,提高活性氧清除速率,延遲鮮切胡蘿卜的衰老。
APX是以抗壞血酸為電子供體的專一性強(qiáng)的過氧化物酶,能催化抗壞血酸與H2O2發(fā)生氧化-還原反應(yīng),是植物體內(nèi)清除H2O2的關(guān)鍵酶,APX活性的升高有利于植物體內(nèi)H2O2的清除[21]。如圖3所示,隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)APX活性呈波動(dòng)下降的趨勢(shì),但經(jīng)NO處理的胡蘿卜其APX活性明顯高于空白組(p<0.05)。這說明NO處理能夠提高鮮切胡蘿卜的APX活性,減少切割過程中H2O2。
圖3 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜抗壞血酸過氧化物酶活性的影響Fig.3 Effect of NO treatment on the activity of ascorbate peroxidase in fresh-cut carrots
電導(dǎo)率是反映植物膜系統(tǒng)狀況的一個(gè)重要指標(biāo),當(dāng)植物受到逆境傷害或其他損傷時(shí),細(xì)胞膜受損,胞液外滲進(jìn)而導(dǎo)致電導(dǎo)率增大[22]。如圖4所示,2組電導(dǎo)率在貯藏期間均呈現(xiàn)相對(duì)上升趨勢(shì),但NO處理能有效抑制電導(dǎo)率上升的速率,在整個(gè)貯藏過程中處理組的電導(dǎo)率值明顯低于空白組(p<0.05)。這表明NO 處理可以有效減少細(xì)胞膜受傷害程度,降低膜脂過氧化反應(yīng)發(fā)生速率。
圖4 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜相對(duì)電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effect of NO treatment on relative electrolytic leakage fresh-cut carrots
LOX作為催化膜脂過氧化反應(yīng)的關(guān)鍵酶,與果蔬細(xì)胞膜脂過氧化關(guān)系密切。LOX一方面破壞植物細(xì)胞的膜系統(tǒng),一方面生成脫落酸促進(jìn)乙烯含量的增加,加速果蔬衰老[18]。如圖5所示,2組LOX活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。但經(jīng)NO處理過的胡蘿卜其活性顯著小于空白組(p<0.05),這說明NO處理能有效抑制LOX活性,阻礙胡蘿卜膜脂過氧化進(jìn)程。
圖5 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜脂氧合酶活性的影響Fig.5 Effect of NO treatment on activity of lipoxygenase in fresh-cut carrots
果蔬在成熟衰老過程中,遭到機(jī)械損傷后會(huì)產(chǎn)生膜脂過氧化現(xiàn)象,丙二醛是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一,其含量是衡量脂膜過氧化程度的重要指標(biāo)[23]。丙二醛含量的積累對(duì)果蔬細(xì)胞的質(zhì)膜和細(xì)胞器會(huì)造成一定的傷害。如圖6所示,空白組與處理組的丙二醛含量總體變化一致,均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。處理組的丙二醛含量明顯小于空白組(p<0.05),這說明NO處理后鮮切胡蘿卜細(xì)胞受損程度低,膜脂過氧化進(jìn)程緩慢,在一定程度上延遲了胡蘿卜的衰老。
圖6 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜丙二醛含量的影響Fig.6 Effect of NO treatment on the content of malondialdehyde in fresh-cut carrot
PPO通常被認(rèn)為是引起果蔬發(fā)生褐變的重要酶,也是在果蔬傷害反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的酶[24]。如圖7所示,在整個(gè)貯藏期內(nèi)PPO活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),經(jīng)NO處理的胡蘿卜其PPO活性顯著低于空白組(p<0.05)。這與WANG[25]等研究結(jié)果相一致,切割后PPO活性均有所上升。PPO活性上升可能是因?yàn)橛捎诤}卜受到切割后導(dǎo)致體內(nèi)結(jié)合態(tài)的酶變成游離態(tài)的酶、也可能是在翻譯水平上提高了酶活、還可能是2種可能共同作用的結(jié)果[26]。后期PPO活性下降可能是因?yàn)楹}卜組織衰老導(dǎo)致的。這說明NO處理能有效抑制PPO活性的升高,降低鮮切胡蘿卜白化發(fā)生速率。
圖7 NO處理鮮切胡蘿卜多酚氧化酶活性的影響Fig.7 Effect of NO treatment on the activity of peroxidase in fresh-cut carrots
POD廣泛的存在于植物體中,是活性較高的一種酶。在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中其活性不斷發(fā)生變化[27]。有研究表明POD也是木質(zhì)化所必須的酶,其活性因切割而增強(qiáng)[28]。如圖8所示,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),POD活性呈現(xiàn)波動(dòng)上升下降的趨勢(shì)。經(jīng)NO處理過的鮮切胡蘿卜其POD活性明顯低于空白組(p<0.05)。這說明NO處理能夠有效抑制POD活性的升高,延緩果蔬衰老,延長(zhǎng)貯藏期。這與 CHAUHAN等在胡蘿卜條中的測(cè)定結(jié)果相同[29]。
圖8 NO處理鮮切胡蘿卜POD活性的影響Fig.8 Effect of NO treatment on the activity of POD in fresh-cut carrots
PAL是果蔬苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶,在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是植物主要防御酶之一?,F(xiàn)已有研究表明,果蔬在采后處理中的傷害可以誘導(dǎo)PAL活性增加,PAL活性增加可以促進(jìn)木質(zhì)素、酚類等次級(jí)代謝產(chǎn)物合成[30]。如圖9所示,在整個(gè)貯藏期內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng)PAL活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。經(jīng)NO處理過的鮮切胡蘿卜其PAL活性顯著低于空白組(p<0.05)。這說明經(jīng)NO處理能有效的降低果蔬受傷害程度,進(jìn)而降低PAL活性。
圖9 NO處理鮮切胡蘿卜苯丙氨酸解氨酶活性的影響Fig.9 Effect of NO treatment on the activity of phenylalanine ammonia lyase in fresh-cut carrots
鮮切胡蘿卜經(jīng)切割受損后,激活了體內(nèi)苯丙烷代謝途徑,誘導(dǎo)了PAL活性上升,促進(jìn)組織細(xì)胞產(chǎn)生酚類、類黃酮、木質(zhì)素等次級(jí)代謝產(chǎn)物積聚在組織傷口及其臨近部位來抵御傷口受損[31]。如圖10所示,在整個(gè)貯藏期間內(nèi)2組總酚含量均呈現(xiàn)平緩上升趨勢(shì),NO處理后鮮切胡蘿卜總酚含量始終低于空白組。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)類黃酮含量呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì),經(jīng)NO處理的鮮切胡蘿卜的類黃酮含量始終低于空白組(p<0.05)(見圖11)。鮮切胡蘿卜受到機(jī)械傷害后機(jī)體會(huì)發(fā)生木質(zhì)化,使其表面產(chǎn)生白色的次生代謝物質(zhì)—木質(zhì)素,影響產(chǎn)品感官、降低產(chǎn)品價(jià)值??偡邮悄举|(zhì)素的合成前體,減少總酚含量能夠抑制木質(zhì)素的合成,延遲了胡蘿卜的白化進(jìn)程,保持了產(chǎn)品的外觀質(zhì)量??傮w說明NO處理過的鮮切胡蘿卜經(jīng)切割后組織細(xì)胞受損程度低,保持了其外觀品質(zhì),延長(zhǎng)了貯藏期。
圖10 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜總酚含量的影響Fig.10 Effect of NO treatment on total phenols content of fresh-cut carrots
圖11 NO處理對(duì)鮮切胡蘿卜類黃酮含量的影響Fig.11 Effect of NO treatment on the flavonoid content of fresh-cut carrots
胡蘿卜經(jīng)去皮、切割后其表面細(xì)胞干燥脫水,易導(dǎo)致白變現(xiàn)象發(fā)生。受到切割傷害后植物組織會(huì)啟動(dòng)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中的抗氧化物酶,如APX、CAT等清除活性氧,減輕植物氧化損傷,從而延緩其衰老[32]。苯丙烷代謝在植物防御過程中起到重要作用,代謝相關(guān)酶如PAL、PPO、POD等和代謝產(chǎn)物如總酚、類黃酮等的變化與植物各類生理變化密切相關(guān)[33]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)NO處理過的鮮切胡蘿卜能夠誘導(dǎo)其組織內(nèi)抗氧化酶APX和CAT活性增強(qiáng),并抑制LOX活性,降低電導(dǎo)率、減少丙二醛含量積累,從而有效提高胡蘿卜組織內(nèi)抗氧化能力,降低過氧化物引起的膜功能和結(jié)構(gòu)的破壞,延緩鮮切胡蘿卜的衰老進(jìn)程。此外,NO處理降低胡蘿卜中參與植物苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL及PPO、POD的活性,顯著減少了苯丙烷代謝產(chǎn)物總酚和黃酮含量,延遲了胡蘿卜白化進(jìn)程的發(fā)生,保持了胡蘿卜的外觀品質(zhì)。綜上所述,NO處理可以通過提高鮮切胡蘿卜的抗氧化和降低苯丙烷代謝的能力,減少總酚等次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累來延長(zhǎng)其衰老,保持其感官品質(zhì)。
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