“肽植”固體飲料的體外活性和對斑馬魚肝臟保護(hù)作用的評價

賈福懷，韓曉峰，李志軍，馬芙俊，文劍，苑鵬，段盛林*

1(寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波，315012) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

隨著社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，我國居民的生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了深刻變化，不合理膳食引發(fā)的多種慢性疾病成為威脅人們健康的重大隱患。我國政府業(yè)已認(rèn)識到營養(yǎng)干預(yù)對慢性病的預(yù)防與治療有關(guān)鍵作用，并期望通過倡導(dǎo)健康生活方式和指導(dǎo)合理飲食結(jié)構(gòu)，預(yù)防慢性疾病的發(fā)生?！八幨惩础敝饕侵甘澄锱c草藥同一來源，藥食同源亦食亦藥，它不僅可以充饑，還具有營養(yǎng)、保健、防病治病等多種功能[1]。我國具有悠久的“醫(yī)食同源”傳統(tǒng)理念和豐富的藥食兩用資源。例如枸杞子富含枸杞多糖，甜菜堿和維生素A，性質(zhì)溫和，具有益精明目，滋補肝腎的作用[2]；蒲公英則富含多種維生素和礦物質(zhì)，常用于清熱解毒，利尿消炎；甘草的有效成分為甘草甜素、甘草次酸、甘草苷元、甘草多糖，具有補脾益氣、潤肺止咳、緩急止痛之功效。

近些年，具有生理活性的肽作為介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，已經(jīng)成為藥理和功能保健食品等研究領(lǐng)域的明星[3]。玉米低聚肽是將玉米蛋白經(jīng)酶解后，通過小肽分離技術(shù)而得到的小分子多肽，具有營養(yǎng)豐富，易于吸收，水溶性和穩(wěn)定性好，不受腸胃環(huán)境影響等優(yōu)點[4]。玉米低聚肽不但具有降血壓、抗疲勞、抗氧化的功能特性，也有研究表明其具有降低甘油三酯和保肝護(hù)肝等作用[5]。

斑馬魚(Zebrafish)因其身體兩側(cè)的藍(lán)白相間條紋類似斑馬而得名，是一種原產(chǎn)于南亞的淡水魚。由于斑馬魚與人類基因的相似度超過80%[6]，同時具有物種穩(wěn)定，飼養(yǎng)方便，胚胎通透，便于觀察等特點，斑馬魚已經(jīng)成為疾病模型建立、毒理學(xué)評價和藥物篩選等研究領(lǐng)域中的模式動物新星[7]。對乙酰氨基酚臨床上常用于解熱鎮(zhèn)痛，但對肝臟有嚴(yán)重的損傷副作用[8]；以對乙酰氨基酚為底物，以存活率、肝臟面積、肝臟明亮度和卵黃囊吸收延遲面積等為評價指標(biāo)的斑馬魚肝損傷模型研究業(yè)已成熟[9]。

本文考察了一款“肽植”固體飲料的體外抗氧化性和促進(jìn)甘油三酯(TG)代謝的能力，并選用受精后3 d(3dpf)的野生型AB品系斑馬魚，觀察“肽植”固體飲料對對乙酰氨基酚誘發(fā)的斑馬魚肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“肽植”固體飲料粉末(由小麥低聚肽1.67%、玉米低聚肽12.50%、甘草提取物0.83%、枸杞子提取物2.50%、蒲公英提取物2.50%、小麥胚芽粉16.67%、麥芽糊精17.5%、綠豆粉20.83%、藕粉25.00%等組成)，寧波養(yǎng)生之家健康科技有限公司提供；蜂王漿，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂所提供；紅棗阿膠枸杞粉、捷森蜂蜜脆麥片(德國產(chǎn))、核桃阿膠粉、普通面粉，均購自超市。陰涼柜避光保存。

福林試劑、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、油酸(oleic acid，OA)、棕櫚酸(palmitic acid，PA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、胰蛋白酶、油紅O染色劑，美國Sigma化學(xué)公司；DMEM培養(yǎng)基、噻唑蘭(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenylterazolium bromide，MTT)、胰蛋白酶、平衡鹽緩沖液(hank’s balanced salt solution，HBSS)，太和華美(北京)醫(yī)藥科技股份有限公司；新西蘭加強型小牛血清，北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；無FFA牛血清蛋白(FFA-free bovine serum albumin，BSA)，日本W(wǎng)AKO公司；RIPA細(xì)胞裂解液，碧云天生物技術(shù)研究所；甘油三脂(triglycerol，TG)試劑盒，南京建成泰浩生物科技有限公司； RU-21(批號25747)，Spirit Sciences USA；4%多聚甲醛，鼎國生物；對乙酰氨基酚(acetaminophen)、N-乙酰半胱氨酸(簡稱NAC)、甲基纖維素，阿拉丁試劑(上海)有限公司；無水乙醇、鐵氰化鉀、FeCl3、三氯乙酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；6孔板，Nest Biotech China。

1.2 儀器與設(shè)備

微量移液槍，德國Eppendorf 公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，解剖顯微鏡SZX7(帶相機)，日本Olympus公司；生物安全柜，中國濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；37 ℃ CO2培養(yǎng)箱，日本松下公司；pH計、精密電子天平CP214，瑞士Mettler Toledo 公司；熒光顯微鏡AZ100，日本尼康公司；759-紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；DK-8D三溫三控水槽，上海博迅實業(yè)有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHA-B水浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造廠；全波長酶標(biāo)儀，美國熱電集團(tuán)；高速冷凍離心機，美國貝克曼公司。

1.3 實驗細(xì)胞與實驗動物

1.3.1 肝癌細(xì)胞株(HepG2)

中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院保存。

1.3.2 斑馬魚

野生型AB品系斑馬魚，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2012-0171(AAALAC)。挑選正常雌雄成魚交配產(chǎn)卵，收集受精卵培養(yǎng)3 d，孵化的幼魚用于實驗。飼養(yǎng)基礎(chǔ)用水為28 ℃，每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導(dǎo)作用為 480～510 μs/cm；pH為 6.9～7.2；硬度為 53.7～71.6 mg/L CaCO3。

1.4 實驗供試液的配制

1.4.1 抗氧化實驗待測液的配制

精密稱取“肽植”固體飲料產(chǎn)品、蜂王漿、脆麥片、普通面粉、紅棗阿膠粉、核桃阿膠粉各24g(固體樣品經(jīng)機械粉碎，過60 目篩)，分別置于100 mL圓底燒瓶中，加入30 mL乙醇與水混合液(體積比1∶1)，常溫下超聲提取30 min共3次，合并提取液，離心(3 000 r/min，10 min)，取上清溶液，定容到100 mL，即得樣品溶液，濃度為240 mg/mL。

1.4.2 細(xì)胞實驗對照組溶液、模型組溶液和樣品溶液的配制

稱取1.0 mg BSA和100 mL無糖無酚紅的DMEM培養(yǎng)基(預(yù)熱至50 ℃)于藍(lán)蓋瓶中混勻，加入450 mg葡萄糖，待葡萄糖溶解后用0.22 μm過濾器過濾2次，得到的即為25G 1% BSA的對照組溶液。

稱取2.0 mg BSA和200 mL無糖無酚紅的DMEM培養(yǎng)基(預(yù)熱至50 ℃)于藍(lán)蓋瓶中混勻，然后稱取40.6 mg的油酸鈉、18.6 mg的棕櫚酸鈉(其摩爾比為2∶1)和500 μL蒸餾水于2 mL離心管中，70 ℃水浴加熱，直至其全部溶解且為透明狀態(tài)，逐滴加到培養(yǎng)基中超聲混勻，0.22 μm過濾器過濾，再加入360 mg葡萄糖和540 mg果糖，全溶后用0.22 μm過濾器再過濾1次，得到的即為10G 15F 1 mmol/L FFA的模型組溶液。

將“肽植”固體飲料粉過60目篩，制成濃度為5 mg/mL的母液，過0.22 μm濾膜，備用。

所有細(xì)胞實驗的受試溶液于-20 ℃保存?zhèn)溆茫褂们胺跤?7 ℃。

1.4.3 斑馬魚實驗用溶液的配制

肽植固體飲料粉過60目篩，用純水配制成50 mg/mL母液，用養(yǎng)魚用水按需稀釋。

1.5 實驗方法

1.5.1 總還原力的測定

通過預(yù)試驗的篩選[10]，分別加入pH 6.6 的PBS 緩沖液1.0 mL、1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL、不同質(zhì)量濃度待測液1.0 mL于試管中，搖勻后置于50 ℃水浴鍋中加熱20 min，待冷卻后再加入1%三氯乙酸2.5 mL并搖勻，離心(3 000 r/min，10 min)，吸取2.0 mL于另一只試管中，并加入蒸餾水5.0 mL 和0.1%三氯化鐵1.0 mL，混勻后靜置10 min，于700 nm 處測定反應(yīng)體系的OD 值，每組實驗重復(fù)3次，繪制總還原能力變化曲線[11]。

1.5.2 DPPH自由基的清除能力的測定

通過預(yù)試驗的篩選[12]，分別取5個不同濃度梯度的各個樣品溶液1.0 mL，DPPH自由基溶液1.0 mL，作為A1組，吸光度值為A1；分別取待測液1.0 mL，50%乙醇1.0 mL，作為A2組，吸光度值為A2；DPPH自由基溶液1.0mL，50%乙醇1.0 mL，為A0參比值。測定各個濃度梯度和對比、參比樣品在517 nm波長處的吸光度，每組實驗重復(fù)3次。在線性范圍內(nèi)計算半數(shù)有效濃度IC50值(數(shù)值越小DPPH自由基的清除能力越強)。

(1)

1.5.3 細(xì)胞內(nèi)TG含量的測定

采用游離脂肪酸(FFA)(油酸與棕櫚酸的混合物，V(油酸)∶V(棕櫚酸)=2∶1)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立脂肪變性細(xì)胞模型[13]。以此模型為研究對象，給予含不同濃度的“肽植”固體飲料的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，通過MTT法測定細(xì)胞活性，篩選受試物的最佳作用濃度。實驗隨機分為模型組(FFA)、正常組(對照，非誘導(dǎo)的正常HepG2細(xì)胞)以及不同濃度的藥物組。將孔板內(nèi)待測細(xì)胞用PBS潤洗2次后，加入RIPA裂解液。充分裂解后，用TG試劑盒測定TG含量。結(jié)果以對模型組的百分比表示(%)。

1.5.4 對乙酰氨基酚誘發(fā)肝損傷保護(hù)作用的斑馬魚實驗

根據(jù)肝損傷保護(hù)最大耐受濃度(MTC)摸索實驗，確定“肽植”固體飲料對肝損傷保護(hù)模型斑馬魚的MTC為50 μg/mL，因此實驗濃度設(shè)置為：5.6 μg/mL(1/9 MTC)、16.7 μg/mL(1/3 MTC)和50 μg/mL(MTC)。

隨機選取180尾斑馬魚于六孔板中，每孔(實驗組)均處理30尾斑馬魚，用對乙酰氨基酚誘發(fā)斑馬魚肝損傷。分別給予“肽植”固體飲料濃度5.6、16.7和50 μg/mL，陽性對照藥N-乙酰半胱氨酸(以下簡稱NAC)濃度1.6 μg/mL，同時設(shè)置正常對照組(養(yǎng)魚用水處理斑馬魚)和模型對照組，每孔(實驗組)容量為3 mL?！半闹病惫腆w飲料與對乙酰氨基酚共同處理48 h后，每個實驗組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并采集數(shù)據(jù)，用NIS-Elements D 3.10 高級圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計算斑馬魚肝臟面積(A)、肝臟明亮度平均值(S)和卵黃囊吸收延遲面積(A)，進(jìn)行定量分析，并統(tǒng)計，統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果用mean±SE表示?！半闹病惫腆w飲料肝損傷保護(hù)作用計算公式如下：

(2)

(3)

(4)

式中:A1～A3、S1～S3、A4～A6分別為正常對照組、模型對照組和實驗組(NAC+“肽植”固體飲料)的肝臟面積、肝臟明亮度和卵黃囊吸收延遲面積。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.1 軟件進(jìn)行單因素方差(One-Way ANOVA)分析，來判斷顯著性差異，p<0.05代表有顯著性差異，p<0.01,p<0.001代表有極其顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化實驗——總還原力

所有樣品隨濃度的增大，其總還原力均呈現(xiàn)增長的趨勢；在各個樣品終點濃度相同的情況下(24 mg/mL)，對照樣品中只有紅棗阿膠粉的總還原力較高(OD=0.20)，與“肽植”固體飲料的總還原力比較接近(OD=0.25)，其中吸光度OD值越大，總還原力越強，見圖1。所有受試樣品中，“肽植”固體飲料的總還原力最強。

圖1 各樣品總還原力對比Fig.1 Comparison on Fe3+ reducing power of different samples

2.2 抗氧化實驗——DPPH自由基清除能力

除蜂王漿和普通面粉以外，受試樣品隨濃度的增大，其DPPH自由基清除率都能達(dá)到或接近100%，且在較低濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系。如圖2所示，在線性范圍內(nèi)計算半數(shù)有效率IC50值(IC50數(shù)值越小DPPH自由基的清除能力越強)，IC50(“肽植”固體飲料)=2.0 mg/mL， IC50(脆麥片)=6.5 mg/mL，IC50(普通面粉)=69.1 mg/mL，IC50(蜂王漿)=36.6 mg/mL，IC50(紅棗阿膠粉) = 4.8 mg/mL，IC50(核桃阿膠粉)=4.5 mg/mL。所有受試樣品中，“肽植”固體飲料的DPPH自由基清除能力最強。

圖2 DPPH自由基清除能力IC50值Fig.2 Comparison on DPPH free radical scavenging ability of different samples

2.3 細(xì)胞內(nèi)TG含量測定

如圖3所示，采用游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞吞噬大量脂肪酸，使得細(xì)胞TG分泌提高、胞內(nèi)TG顯著累積，此模型可以很好地模擬人體肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的狀態(tài)。模型組(OA)細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯高于正常組(對照)，可以表明HepG2細(xì)胞脂肪變性模型造模成功(p<0.001)；同時，各個劑量組細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯比模型組低40%～50%(與模型組比較，各濃度組顯著性差異p<0.001)，盡管沒有體現(xiàn)出明顯的劑量依賴，但是仍表明“肽植”固體飲料可以很好地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的TG含量達(dá)到或接近正常值。

圖3 不同質(zhì)量濃度“肽植”固體飲料對細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響Fig.3 Intracellular TG content in each groups

2.4 “肽植”固體飲料對對乙酰氨基酚誘發(fā)的斑馬魚肝損傷的保護(hù)作用

由表1、圖3和圖4可知，模型對照組與正常對照組比較，斑馬魚肝臟面積、肝臟明亮度平均值和卵黃囊吸收延遲面積的顯著性差異均為p<0.001，表明模型建立成功；陽性對照藥NAC 1.6 μg/mL質(zhì)量濃度組對斑馬魚肝變性有改善作用(改善作用64%，p<0.001)，但是對斑馬魚肝臟萎縮和卵黃囊吸收延遲的改善作用不明顯；“肽植”固體飲料5.6、16.7和50 μg/mL質(zhì)量濃度組對斑馬魚肝臟變性均有改善作用(低劑量和中劑量組改善作用分別為65%、49%，p<0.001，高劑量組46%，p<0.01)。

表1 “肽植”固體飲料處理后斑馬魚肝臟保護(hù)作用(n=10)

注：與模型對照組比較，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

L-肝臟；Y-卵黃囊圖4 各實驗組斑馬魚典型圖Fig.4 Typical picture of zebrafish of the experiment groups

圖5 “肽植”固體飲料處理后斑馬魚肝損傷改善作用對比圖；與模型對照組比較Fig.5 The protective effect on liver of zebrafish treated by “Taizhi” solid drink注：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001 vs control group

3 結(jié)論

活性氧能夠引起細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)失控，造成氧化脅迫和氧化損傷，而枸杞子中含有的枸杞多糖[14]、類黃酮和枸杞色素[15]等成分已經(jīng)被證明具有明顯的抗氧化能力；蒲公英和甘草的黃酮類物質(zhì)也具有較強的清除活性氧的作用[16-17]；另外，玉米低聚肽的體外抗氧化作用同樣得到研究者的證實[18]?！半闹病惫腆w飲料的主要是由枸杞子、蒲公英、甘草和玉米低聚肽等成分研制而成，本文通過抗氧化實驗研究發(fā)現(xiàn)，此款固體飲料具有很好的抗氧化能力，能夠清除人體體內(nèi)的自由基，起到抗老化和保護(hù)器官的作用。GOMEZ-LECHON采用混合脂肪酸V(油酸)∶V(棕櫚酸)=2∶1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪變性的方法[19]，是一種比較經(jīng)典的評價脂質(zhì)代謝作用的模型，本實驗通過對此種評價模型實驗結(jié)果的分析，可以表明“肽植”固體飲料具有很好的調(diào)控脂質(zhì)代謝作用，有益于高血脂人群對甘油三酯的調(diào)節(jié)。除此之外，本文利用新型模式生物斑馬魚，通過對野生型AB品系斑馬魚肝臟形態(tài)變化和卵黃囊吸收情況的觀察，可以發(fā)現(xiàn) “肽植”固體飲料對對乙酰氨基酚誘發(fā)的斑馬魚肝損傷有保護(hù)作用，表現(xiàn)為肝臟變性程度、肝萎縮和卵黃囊吸收延遲均有明顯改善。綜上所述，此款“肽植”固體飲料不僅具有很好的抗氧化作用，而且能夠調(diào)控脂質(zhì)代謝，有利于慢性炎癥類疾病(如糖尿病和心腦血管疾病)的預(yù)防和控制；同時，具有保護(hù)肝臟的作用，適合非酒精性脂肪肝和慢性肝病人群的輔助調(diào)理。

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