芝麻香型白酒釀造過程中乳酸菌分離及其碳源利用特征

杜海，邢敏鈺，徐巖

(江南大學 釀酒科學與酶技術中心，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

芝麻香型白酒是20世紀60年代出現(xiàn)的一種創(chuàng)新香型的白酒。其生產(chǎn)工藝是結合醬香型白酒和濃香型白酒的工藝優(yōu)點發(fā)展起來的。芝麻香型白酒釀造過程采用清蒸清燒，蒸前高溫潤糧的工藝，高溫堆積、高溫發(fā)酵，高溫發(fā)酵是在泥底磚窖的窖池內完成的。獨特的工藝使芝麻香型白酒既具有突出的焦香，又有輕微的醬香，生成獨特優(yōu)雅的芝麻香味[1]。芝麻香型白酒因其獨具特色的風味吸引了越來越多消費者的喜愛。

除了工藝的創(chuàng)新，芝麻香型白酒釀造還將高溫大曲、麩曲(主要指河內白曲)、生香酵母曲、細菌曲混合使用，做為糖化發(fā)酵劑[2]。其中，河內白曲，由黑曲霉變異而來，能夠耐高溫、耐乙醇，產(chǎn)生的酸性蛋白酶具有較高的糖化力和液化力，因此被廣泛應用于白酒釀造過程[3-5]。酵母曲中通常為Pichiakudriavzevii、Wickerhamomycesanomalus、Saccharomycescerevisiae以及Candidatropicalis等[6]。其中，Saccharomycescerevisiae發(fā)酵產(chǎn)生大量乙醇，是主要的產(chǎn)酒酵母[7-8]。細菌曲主要是由Bacilluslicheniformis、Bacillussubtitles、Bacillusstearothermophilus等芽孢桿菌組成[3, 6]。由于純種菌株的人為添加，芝麻香型白酒發(fā)酵過程中霉菌、酵母、芽孢桿菌的功能相對清楚[6,9]。白酒發(fā)酵過程是由多種微生物共同發(fā)酵產(chǎn)生的，其中來源于釀造環(huán)境的乳酸菌與上述人為添加微生物之間存在一定的相互作用，構成穩(wěn)定的釀造微生物群落進行自然發(fā)酵。乳酸菌的種類及群落動態(tài)對白酒品質至關重要。然而，由于技術水平的局限，對芝麻香型白酒釀造過程中乳酸菌研究較少，對于該香型白酒釀造過程中乳酸菌群結構和代謝特征的認識仍不清楚。

本文旨在通過可培養(yǎng)技術考察芝麻香型白酒發(fā)酵過程中乳酸菌的群落結構，解析乳酸菌的菌群演替規(guī)律，確定芝麻香型白酒中重要的乳酸菌菌種。同時利用BiologGenIII微孔板對可培養(yǎng)乳酸菌對不同碳源的代謝能力進行測定。通過分析乳酸菌對代謝特征，解析不同乳酸菌在白酒發(fā)酵體系的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

BiologGenIII微孔板、厭氧盒等。酒醅樣品均取自某芝麻香型白酒廠，堆積周期為18 h，發(fā)酵周期為50 d。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

M.R.S.肉湯培養(yǎng)基，購于OXOID公司。M.R.S.固體培養(yǎng)基：在M.R.S.肉湯培養(yǎng)基中，加入2%的瓊脂配置而成。飽和苯溶液(pH=7.9±0.2)，購于上海生工。三氯甲烷，購于上海生工。

1.3 采樣方法

樣品為芝麻香型白酒酒醅。芝麻香型白酒除了傳統(tǒng)的手工發(fā)酵方式，還存在機械化操作的生產(chǎn)方式。兩種發(fā)酵過程中的原料、發(fā)酵劑、以及工藝均相同，但是由于操作方式不同，導致發(fā)酵環(huán)境的不同，而乳酸菌大多是來自于發(fā)酵環(huán)境中的。因此，分別采取手工班和機械班的酒醅，用于乳酸菌的研究。

為了科學取樣，分別選擇手工班和機械班各3組堆積樣品進行跟蹤取樣，作為平行樣品。堆積發(fā)酵周期為18 h，每隔6 h取1次樣品，取樣時間分別為0、6、12、18 h。手工班的酒醅在地面直接進行堆積發(fā)酵，堆積酒醅取樣位置如圖1 (a)所示，取樣點為a、b、c、d四個點；機械班的堆積發(fā)酵是在堆積箱中進行的，堆積酒醅的取樣位置如圖1 (b)所示為a～i九個點。不同取樣位置分別取50 g左右的酒醅混合成一個樣品。堆積結束的樣品即為窖池發(fā)酵0 d的樣品。窖池發(fā)酵周期為50 d，取樣時間分別為3、5、10、15、20、25、30、35、40、50 d，取樣位置為a～i九個點，如圖1 (c)所示。在每個取樣點分別取50 g左右的酒醅混合成一個樣品。將采集的酒醅樣品密封，在-80 ℃冰箱中保存。

圖1 酒醅取樣位置示意圖Fig.1 The schematic graph of the sampling sites

1.4 乳酸菌的分離、鑒定

(1)分離：將10 g酒醅樣品溶于100 mL無菌水中，混勻。對其進行梯度稀釋，取10-2、10-3、10-43個稀釋度的菌懸液加入無菌平皿，分別傾入已熔化并冷至40 ℃左右的乙醇濃度5%、10%，pH梯度為4.0、5.0、6.0的M.R.S.固體培養(yǎng)基，立即混勻，待凝固后，放入?yún)捬鹾兄械怪?，?0 ℃、37 ℃厭氧培養(yǎng)。選擇合適梯度的傾注平板，用無菌牙簽盡可能多的挑取單菌落，在新平板的不同區(qū)域進行點種，以菌種原始的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。將點種平板上菌落形態(tài)差異較大的菌株接種M.R.S.肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d左右，取2 mL菌液，用于甘油管保藏，剩余菌液用于提取基因組進行測序，以判斷其種屬。

(2)鑒定：取2 mL菌液，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，加入1 mL無菌水混勻，離心洗滌菌體。加入0.2 mL的無菌水，重懸菌體，將其轉移至含有0.3 g無菌玻璃珠的螺旋管內，再加入0.3 mL酚∶氯仿混合溶液(V∶V=1∶1)。用Beadbeater細胞破碎儀擊打30 s，進行破碎。破碎后，向混合體系內加入0.6 mL的無菌水，顛倒混勻，12 000 r/min離心10min。將上清液轉移至干凈無菌的離心管內，加入上清液二倍體積的冰乙醇。-20 ℃沉淀，過夜。12 000 r/min離心20 min，棄上清，將乙醇用真空干燥箱烘干，加入30 μL無菌水復溶。選擇細菌通用引物27F/1492R對菌株的基因組進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送公司測序，測序結果在NCBI網(wǎng)站與模式菌進行比對，確定菌株的種屬信息。

1.6 乳酸菌碳源代謝能力測定

利用Biolog GenIII微孔板對11株可培養(yǎng)乳酸菌對71種碳源的代謝能力進行測定。具體操作過程：在M.R.S.固體培養(yǎng)基上劃線，分離乳酸菌，挑取單菌落，接種在MRS液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、厭氧條件下靜置培養(yǎng)20 h，9 000 r/min離心10 min，在無菌條件下除去培養(yǎng)基，再加入5 mL的無菌超純水重懸，將菌懸液轉接至接種液中，配成細胞濃度為90%～98% 的菌懸液。將菌懸液加到微孔板上，每孔加入100 μL的量。將微孔板置于30 ℃、厭氧條件下靜置培養(yǎng)48 h。根據(jù)孔內顏色變化確定乳酸菌碳源利用能力的大小。

2 結果與分析

2.1 可培養(yǎng)方法分離到的乳酸菌種

取芝麻香型白酒不同堆積發(fā)酵過程的酒醅樣品，對其進行梯度稀釋，取10-2、10-3、10-43個稀釋度的菌懸液加入無菌平皿，分別傾入已熔化并冷至50 ℃左右的乙醇濃度5%、10%，pH梯度為4.0、5.0、6.0的MRS培養(yǎng)基，立即混勻，待凝固后于厭氧盒中倒置，于37 ℃培養(yǎng)。

選擇合適梯度的傾注平板，并后續(xù)通過劃線方法對菌落進行純化。用無菌牙簽盡可能多的挑取單菌落，在新平板的不同區(qū)域進行點種，以菌種原始的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)。將點種平板上菌落形態(tài)差異較大的菌株接種M.R.S.培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d左右，取2 mL菌液，提取其基因組進行測序，以判斷其種屬，剩余菌液用于甘油管保藏。以傾注平板法從芝麻香型白酒的堆積酒醅樣品獲得了267株菌。

圖2 可培養(yǎng)菌種初篩結果Fig.2 Screening results of strains

2.2 酒醅中乳酸菌的分類鑒定

將初篩獲得菌株分離純化，選取上述菌落形態(tài)差異較大的單菌，接種至M.R.S.肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后，收集菌體，提取單菌基因組，然后用細菌通用引物27F和1492R進行PCR。PCR結果顯示，成功從37個單菌基因組中獲得目標PCR產(chǎn)物。將上述PCR產(chǎn)物進行測序，其中32株被確定為乳酸菌(如表1所示)。

表1 可培養(yǎng)方法分離芝麻香白酒酒醅中乳酸菌鑒定結果

由表1可知，獲得測序結果的32株菌，從種水平可以分為7類，其中A2是Lactobacillusparacasei(副干酪乳桿菌)，A4是Lactobacilluszeae(玉米乳桿菌)，A8、C10是Lactobacillusacidipiscis(嗜酸乳桿菌)，A9是Lactobacillusbuchneri(布氏乳桿菌)，B15是Lactobacillusfermentum(發(fā)酵乳桿菌)，A、A37、B2、B4、B5、B7、B9、B17、B18、B20、B21、B22、B24、B26、C3、C9、C10、C27、C30是Pediococcusacidilactici(乳酸片球菌)，B1、B3、B8、B11、B14、B25、C1、C5是Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)。

與之前醬香型白酒的測序結果對比，發(fā)現(xiàn)新獲得Lactobacillusparacasei(副干酪乳桿菌)、Lactobacillusacidipiscis(嗜酸乳桿菌)、Lactobacillusbuchneri(布氏乳桿菌)、Pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)為芝麻香型白酒和醬香型白酒共有的。

2.3 乳酸菌代謝特征

選擇芝麻香型白酒酒醅中分離獲得的主要乳酸菌PediococcuspentosaceusB24、PediococcusacidilacticiJSA6、LactobacillusparacaseiJJA1、LactobacillusplantarumJD19、LactobacillusfermentumJSA30、Lactobacillusacetotolerans19，白酒發(fā)酵體系中常見的乳酸菌LactobacilluspontisJSC25、LactobacilluspentosusNA、LactobacillusacidipiscisA8、LactobacillusbuchneriA9，以及實驗室前期分離得到的乳酸菌WeissellaviridescensW，進行活化，并接種至Biolog GenIII微孔板進行實驗，考察這11株乳酸菌對于71種不同碳源的利用情況。

如圖3所示，大部分乳酸菌對于糖類物質的利用較強，比如糊精、D-麥芽糖、纖維二糖、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖等。絕大多數(shù)可培養(yǎng)乳酸菌能夠很好地利用葡萄糖，Lactobacillus對糊精的利用能力很好，而Pediococcus對糊精的利用相對較弱，Lactobacillusacetotolerans對于碳源的利用能力普遍弱于其他乳酸菌，Lactobacillusacetotolerans利用能力最強的是糊精，其次是D-果糖、D-葡萄糖、D-海藻糖等。因而在發(fā)酵過程中，可培養(yǎng)乳酸菌對于葡萄糖的消耗要快于糊精，隨著體系中葡萄糖含量的逐漸降低，可培養(yǎng)乳酸菌物種與功能的多樣性將受到碳源利用能力的制約，白酒雙邊發(fā)酵的特點，在一定程度上給乳酸菌發(fā)揮其代謝功能提供了一個相對較好的模式。

乳酸菌對于氨基酸的利用較弱，從整體上看，乳酸菌對于氨基酸的利用能力由強到弱依次為：Pediococcus、Weissella、Lactobacillus。乳桿菌中的LactobacilluspentosusNA、LactobacillusparacaseiJJA1、Lactobacillus

圖3 乳酸菌的碳源利用能力圖Fig.3 Carbon source utilization ability of lactic acid bacteria

plantarumJD19對氨基酸代謝相對較強，能利用的氨基酸種類也較多。氨基酸代謝可以為芳香族化合物形成提供前體物質，LactobacilluspentosusNA、LactobacillusparacaseiJJA1、LactobacillusplantarumJD19可能對芳香類物質的形成具有一定的貢獻。

在乳酸菌碳源利用能力測定實驗中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳酸菌幾乎不能利用有機酸，PediococcusacidilacticiB24、LactobacilluspentosusNA、LactobacillusparacaseiJJA1的有機酸利用能力相對較好，但還是很微弱。這表明大多數(shù)乳酸菌在生長代謝過程中，幾乎不需要利用外來的有機酸，通過有機酸利用能力的測試，可以為研究乳酸菌產(chǎn)相應有機酸能力的研究提供一定的借鑒。

3 討論

乳酸菌是能夠發(fā)酵糖類物質產(chǎn)生乳酸的一類微生物的總稱，乳酸菌通常呈革蘭氏染色陽性，不產(chǎn)孢子，過氧化氫酶實驗陰性，耐酸，最適pH在4.0～4.5，厭氧或耐氧的，菌體形態(tài)各異，有棒狀(桿菌)和球體(球菌)等[10]。由于乳酸菌普遍存在于食品發(fā)酵過程中[11]，對于食品的品質有重要影響，因此，引起了國內外的廣泛關注。

傳統(tǒng)食品發(fā)酵過程中風味物質的生成與乳酸菌群的代謝活動密切相關。乳酸菌能夠產(chǎn)生有機酸[12]，直接影響食品的風味。乳酸菌同型發(fā)酵的產(chǎn)物主要是乳酸，異型發(fā)酵除了乳酸之外，還產(chǎn)生乙酸。乳酸菌代謝產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機酸既可以直接影響食品風味的形成，還能夠以其為底物產(chǎn)生乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質對食品風味產(chǎn)生影響。

在發(fā)酵過程中，乳酸菌具有調節(jié)菌群結構和調控發(fā)酵進程的作用。一方面，乳酸菌能夠通過產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸，產(chǎn)生細菌素等拮抗物質，以及與其他微生物競爭底物等途徑影響其他微生物的生長[13-16]，從而調節(jié)發(fā)酵過程中的菌群結構。另一方面，乳酸菌直接調控發(fā)酵過程，例如Weissella和Leuconostoc能夠啟動發(fā)酵，Lactobacillusplantarum能夠加速發(fā)酵進程[17-18]。因此研究發(fā)酵過程中乳酸菌與其他微生物的相互作用有助于進一步探究發(fā)酵機理。

中國白酒是在開放的生產(chǎn)環(huán)境下，通過多種微生物相互作用共同發(fā)酵產(chǎn)生的[19]。由酒醅微生物和窖池微生物構成的白酒釀造微生物群落自然發(fā)酵，最終形成獨具特色的白酒產(chǎn)品。酒醅微生物構成十分復雜，除了來自大曲的微生物以外，還有各種各樣的環(huán)境微生物[20]。白酒釀造過程中存在細菌、酵母菌和霉菌等各類微生物。細菌既能代謝產(chǎn)生酸類、醛類等物質對白酒風味產(chǎn)生直接影響，也能通過產(chǎn)生淀粉酶、酯化酶等對出酒率和酒的香味產(chǎn)生影響[21]。其中，乳酸菌作為白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細菌，其種類、數(shù)量以及動態(tài)變化對于白酒釀造過程至關重要[22]。

在白酒發(fā)酵的中后期，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵體系內酸度和乙醇濃度的升高，氧氣含量逐漸減少，大部分的微生物不能夠耐受高酸度、高乙醇濃度、厭氧等不利條件而逐漸衰亡，而乳酸菌則成為絕對優(yōu)勢的細菌。乳酸菌的主要產(chǎn)物是乳酸，乳酸能夠減少白酒的刺激感，增加酒體的醇厚感。乳酸菌還能通過異型發(fā)酵途徑產(chǎn)生少量的乙酸，乙酸有一定的刺激性，對白酒產(chǎn)品風味的形成有重要影響。同時，乳酸能夠與其他微生物代謝產(chǎn)生的乙醇發(fā)生反應，生成乳酸乙酯，乳酸乙酯能夠增加酒體的醇甜感、醇厚度，是重要的呈味呈香物質。除此以外，乳酸菌還能夠通過產(chǎn)生有機酸，降低發(fā)酵體系pH，產(chǎn)生拮抗類物質等途徑影響發(fā)酵體系中其他微生物的生長代謝，從而調控整個發(fā)酵過程。因此，白酒乳酸菌引起了越來越多研究人員的關注。

綜上所述，在芝麻香型白酒發(fā)酵過程中，乳酸菌種類豐富，其中既有同型發(fā)酵乳酸菌，也有異型發(fā)酵乳酸菌。而且不同乳酸菌的生長要求不同，對于碳源的選擇性利用和利用能力的大小均存在較大的差異。白酒釀造的原料是高粱等谷物，其主要成分是淀粉，淀粉水解產(chǎn)生糊精、葡萄糖等物質，而乳酸菌對葡萄糖、糊精等物質的利用能力以及發(fā)酵過程中碳源物質的分布對于菌群結構有重要影響。然而，由于篩選條件的設定比較局限，不能滿足所有乳酸菌的生長需求，后續(xù)將結合高通量測序等技術的輔助手段，更加全面的分析乳酸菌群的群落組成和演替。

[1] 來安貴，趙德義，曹建全. 芝麻香型白酒的發(fā)展歷史、現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 釀酒，2009, 36(1)： 91-93.

[2] 劉明明，王君高，孫朋朋，等. 麩曲在芝麻香型白酒生產(chǎn)中的應用[J]. 釀酒科技，2013(3)： 69-74.

[3] 李環(huán)宇. 芝麻香型白酒工藝探究[J]. 泰安：山東輕工業(yè)學院，2010.

[4] 唐勝球，董小英. 酒用酸性蛋白酶的研究進展[J]. 釀酒科技，2005(1)：41-44.

[5] 雷軍，宣靈，黃龍龍，等. 河內白曲酸性蛋白酶活力與酸度相關性探究[J]. 釀酒，2015, 42(2)： 83-85.

[6] 張彬. 芝麻香型白酒專用曲的生產(chǎn)及應用[J]. 釀酒，2012, 39(6)：38-41.

[7] NYANGA L K, NOUT M J R, SMID E J. et al. Fermentation characteristics of yeasts isolated from traditionally fermented masau (Ziziphusmauritiana) fruits[J]. International Journal of Food Microbiology，2013, 166(3)： 426-432.

[8] CANAS P M I, GARCIA-ROMERO E, MANSO J M H, et al. Influence of sequential inoculation ofWickerhamomycesanomalusandSaccharomycescerevisiaein the quality of red wines[J]. European Food Research and Technology，2014, 239(2)： 279-286.

[9] WU Q， LING J， XU Y. Starter culture selection for making Chinese sesame-flavored liquor based on microbial metabolic activity in mixed-culture fermentation[J]. Applied and Environmental Microbiology，2014, 80(14): 4 450-4 459.

[10] CALO-MATA P, ARLINDO S, BOEHME K, et al. Current applications and future trends of lactic acid bacteria and their bacteriocins for the biopreservation of aquatic food products[J]. Food and Bioprocess Technology，2008, 1： 43-63.

[11] LIU S N, HAN Y, ZHOU Z J. Lactic acid bacteria in traditional fermented Chinese foods[J]. Food Research International，2011, 44(3)： 643-651.

[12] WU Z F， ZHUANG B W， WENG P F, et al. Fermentation quality characteristics and flavor formation changes during the process of pickled wax gourd in eastern zhejiang[J]. International Journal of Food Properties，2016, 19(2): 409-419.

[13] LE LC, COTON E, CHOBERT JM, et al. Identification and quantification of antifungal compounds produced by lactic acid bacteria and propionibacteria[J]. International Journal of Food Microbiology，2016, 239: 79-85.

[14] GEREZ C L, TORRES M J, DE VALDEZ G F, et al.Control of spoilage fungi by lactic acid bacteria[J]. Biological Control，2013, 64(3): 231-237.

[15] MAGNUSSON J, STROM K, ROOS S, et al. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria[J]. Fems Microbiology Letters，2003, 219(1): 129-135.

[16] DALIE D K D, DESCHAMPS A M, Richard-Forget F. Lactic acid bacteria - Potential for control of mould growth and mycotoxins: A review[J]. Food Control，2010, 21(4): 370-380.

[17] JUNG J Y, LEE S H, JEON C O. Kimchi microflora: history, current status, and perspectives for industrial kimchi production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2014, 98(6): 2 385-2 393.

[18] LEE M E, JANG J Y, LEE J H, et al. Starter cultures for kimchi fermentation[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，2015, 25(5): 559-568.

[19] 邱并生. 混菌發(fā)酵對白酒液態(tài)發(fā)酵效率和風味物質的影響[J]. 微生物學通報，2014, 41(1): 1 477-1 478.

[20] 喬宗偉,張文學，張麗鶯，等, 濃香型白酒發(fā)酵過程中酒醅的微生物區(qū)系[J]. 釀酒，2005, 32(1)： 18-21.

[21] 庾昌文,薛棟升，周敏，等, 清香型小曲白酒機械化釀造過程中細菌多樣性及釀造性能分析[J]. 湖北農業(yè)科技，2016(11)： 2 860-2 863.

[22] 吳莉莉, 王海燕, 徐巖,等, 醬香型與清香型白酒發(fā)酵過程中乳酸菌菌群的差異性分析[J]. 微生物學通報， 2013, 40(12)： 2 182-2 188.