谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶熱穩(wěn)定劑優(yōu)化

任立均，劉龍*，劉松，堵國成，陳堅

1(江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase, TGase, EC 2.3.2.13)，能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的 γ-羧酰胺基與賴氨酸 ε-?；蚱渌；磻?，形成 ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸共價鍵，從而使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，達到提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)以及改善蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的。特殊的催化能力使得該酶作為一種新型的酶制劑被廣泛應用于食品工程、材料工程、紡織與皮革加工、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。然而，較低的熱穩(wěn)定性使商品化的TGase主要通過高能耗的冷凍干燥制備酶粉，同時常溫下液體TGase儲存穩(wěn)定性不佳。因此，選擇適合的保護劑提高TGase的熱穩(wěn)定性對該酶的應用有重要意義[2]。

目前，關(guān)于TGase熱穩(wěn)定性的研究已有大量報道?；谥亟M表達系統(tǒng)，研究者對TGase進行分子改造提高酶穩(wěn)定性，包括定點突變[3]、融合雙親短肽[3]、引入二硫鍵[4]等。此外，固定化TGase[5]和鄰苯二甲酸酐修飾亦被用于TGase的穩(wěn)定化改造[6]。盡管分子改造及化學修飾能有效改善TGase的熱穩(wěn)定性，但由于轉(zhuǎn)基因及化學殘留的安全隱患限制了其在食品工業(yè)中的應用。通過添加食品安全的穩(wěn)定劑能有效避免上述問題，是一種經(jīng)濟、便捷、有效的酶穩(wěn)定化方法。已有的研究表明，糖類(海藻糖、蔗糖、果糖)[7-10]、醇類[11-13]、鹽類[14]能有效提高堿性磷酸酶、過氧化氫酶、木瓜蛋白酶等的熱穩(wěn)定性。

本研究首先通過單因素實驗從糖類、鹽類、醇類等中篩選對TGase熱穩(wěn)定性有明顯作用的穩(wěn)定劑，然后進行正交實驗，獲得了能顯著提高TGase熱穩(wěn)定性的配方。研究結(jié)果將進一步促進TGase的工業(yè)化生產(chǎn)與應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑

StreptoverticilliummobaraenseTGase(酶活≥1 500 U/g)，小麥蛋白：江蘇一鳴生物制品有限公司；N-carboxybenzoyl-L-glutaminylglycine (N-CBZ-Gln-Gly)，L-谷氨酸-γ-單羥胺酸：色譜純，上海Sigma-Aldrich 公司；還原型谷胱甘肽：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；胰蛋白胨：分析純，英國Oxoid公司；脫脂奶粉：澳大利亞Devondale Murray Goulburn合作社；大豆蛋白：分析純，河南恒銳食品添加劑有限公司；精氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、亮氨酸：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙三醇、山梨醇、聚乙二醇1000(Polyethylene glycol 1000, PEG1000)、葡萄糖、蔗糖、α-乳糖、海藻糖、NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4：分析純，上海國藥集團。

1.1.2 主要溶液[3]

(1) 溶液A(反應底物液)

0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH 6.0)、0.1 mol/L鹽酸羥胺、0.01 mol/L還原型谷胱甘肽、10 g/L CBZ-GLN-GLY(Nalpha-Carbobenzyloxy-Glutamine Glycine)(溶于0.2 mol/L NaOH中)4種試劑以2∶1∶1∶1混合配置，pH 6.0，現(xiàn)配現(xiàn)用，冰箱存放。

(2) 溶液B(終止劑)

3 mol/L HCl、12%三氯乙酸、5% FeCl3· 6 H2O(溶于0.1 mol/L HCl中)3種試劑以1∶1∶1混合配制。

(3) 磷酸鹽緩沖液

0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH 7.4。

1.2 儀器與設備

DKB-600A型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；高速離心機(CR22GⅡ)；日本 HITACHI 公司；紫外可見光分光光度計(Shimadzu UV-2450)；日本 Shimadzu 公司；Cytation3細胞成像多功能檢測系統(tǒng)；美國伯騰儀器有限公司；Eppendorf 5424 高速離心機；美國 Eppendorf 公司；pH計，瑞士 Mettler-Toledo公司；制冰機，北京科創(chuàng)百方科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

TGase酶粉用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液溶解，定量稱取各種穩(wěn)定劑，使酶粉分別與各個穩(wěn)定劑充分混溶，控制各實驗組中TGase的初始酶活在1.5 U/mL左右，穩(wěn)定劑的質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40、50 g/L。

1.3.2 TGase酶活測定

比色法測定酶活[15]。用 α-N-CBZ-Gln-Gly 為作用底物，L-谷氨酸-γ-單羥胺酸做標準曲線。1個單位TGase 酶活定義為：在37 ℃條件下，每分鐘催化上述底物形成 1 μmol的L-谷氨酸-γ-單羥胺酸的酶量(U/mL)。 酶活測定條件為37 ℃條件下反應10 min。

1.3.3 TGase熱穩(wěn)定性檢測

本實驗以TGase的t1/2(55 ℃)(即TGase在55 ℃熱處理下酶活降低到初始酶活一半所需的時間)作為衡量TGase熱穩(wěn)定性的指標。同時用55 ℃水浴處理預冷的對照組TGase和實驗組TGase，前30 min內(nèi)每隔3 min取樣，之后每隔10 min 取樣，樣品立即置于冰上冷卻3 min，隨后按照1.3.2測TGase的殘余酶活力。酶的t1/2可通過作活力-時間圖解得[16]。

1.3.4 TGase最適反應溫度測定

按照1.3.2測定不同溫度下TGase的酶活，定義37 ℃下各組的殘余酶活率為100%，比較添加復合配方的實驗組與對照組的殘余酶活率。

1.3.5 TGase在不同溫度下的熱穩(wěn)定性檢測

將各組在不同溫度下熱處理1 h后按照1.3.2測定各組保溫前后TGase的酶活，定義各組的殘余酶活率為：

1.3.6 TGase常溫儲存穩(wěn)定性檢測

將各組在常溫(25 ℃)下儲存80 d，每隔10天按照1.3.2測定各組TGase的酶活，定義各組第0天的殘余酶活率為100%，比較實驗組與對照組儲存不同時間的殘余酶活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖對TGase熱穩(wěn)定性的影響

糖類是一種常被用來研究酶熱穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑，糖類中的氫鍵能夠降低蛋白質(zhì)的自由能，這對維持蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有重要的作用[17]。本實驗選用了4種糖類(葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、海藻糖)進行研究，結(jié)果如圖1。4種糖類對熱處理下的TGase穩(wěn)定性均有積極影響。其中50 g/L葡萄糖的保護效果最為明顯，55 ℃下TGase的t1/2達到了34.74 min，比對照9.74 min提高了256.67%。大量的報道表明，在酶液中添加糖類，如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖等能有效改善疏水相互作用，改變?nèi)芤旱谋砻鎻埩17]，提高酶的熱穩(wěn)定性。

A-葡萄糖；B-乳糖；C-蔗糖；D-海藻糖圖1 糖類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.1 The effects of saccharides on t1/2(55 ℃) of TGase

2.2 醇對TGase熱穩(wěn)定性的影響

多元醇也是一種有效的酶穩(wěn)定劑，山梨醇和甘油是多元醇中最常被用作蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的兩種，不同的作用機制被用來解釋這兩種醇對酶的穩(wěn)定作用，包括優(yōu)先水合，包埋蛋白，優(yōu)先排斥變性蛋白等[18]。本實驗選用了3種醇類(山梨醇、甘油、PEG1000)進行研究。如圖2，3種醇類均促進了TGase熱穩(wěn)定性，其中50 g/L的山梨醇使55 ℃下TGase的t1/2達到34.81 min，比對照提高257.39%。文獻顯示，甘油和山梨醇能在一定程度上幫助蛋白質(zhì)抵抗熱變性[11-13]。一般認為，醇類是通過羥基與酶分子的相互作用[19]及降低介質(zhì)的介電常數(shù)來加強酶分子的疏水作用[20]，從而改善酶的熱穩(wěn)定性。

A-山梨醇；B-甘油；C-PEG1000圖2 醇類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.2 The effects of polyols on t1/2(55 ℃) of TGase

2.3 鹽對TGase熱穩(wěn)定性的影響

有研究表明，添加不同的鹽能增加酶的熱穩(wěn)定性[14]。毛新煥等人通過研究一些金屬硫酸鹽還發(fā)現(xiàn)某些金屬的硫酸鹽對辣根過氧化物酶具有一定的穩(wěn)定作用[21]。本實驗選用4種鹽類(NaCl, KCl, NH4Cl, (NH4)2SO4)進行研究。如圖3，低濃度KCl、NH4Cl和(NH4)2SO4對TGase的保護均隨著濃度的增大而作用增強。 50 g/L的KCl、NH4Cl和(NH4)2SO4影響下TGase的t1/2分別較對照提高6.84倍、8.65倍和12.68倍，40 g/L的NaCl使TGase的t1/2達到107.24 min，較對照提高10倍。這說明選擇的4種金屬陽離子和硫酸根離子均對酶的熱穩(wěn)定有良好的保護效果。

(A)NaCl；(B)KCl；(C)NH4Cl；(D)(NH4)2SO4圖3 鹽類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.3 The effects of salts on t1/2(55 ℃) of TGase

2.4 蛋白質(zhì)和多肽對TGase熱穩(wěn)定性的影響

為了保護目標蛋白在逆境環(huán)境中的穩(wěn)定性，也有研究者曾嘗試將一些保護性蛋白和多肽添加到目標蛋白溶液中，如大豆多肽，谷朊粉，脫脂乳等，這些物質(zhì)在保護TGase的熱穩(wěn)定性方面均取得了良好的效果[22]。本實驗選用4種物質(zhì)(胰蛋白胨、脫脂乳粉、大豆蛋白、小麥蛋白)進行研究。

(A)胰蛋白胨；(B)脫脂乳粉；(C)大豆蛋白；(D)小麥蛋白圖4 蛋白質(zhì)和多肽對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.4 The effect of proteins and peptide on t1/2(55 ℃) of TGase

由圖4可知，4種物質(zhì)均能改善TGase熱穩(wěn)定性，其中小麥蛋白的影響較為顯著，50 g/L的小麥蛋白使TGase的t1/2達到135.02 min，較對照提高12.86倍。有學者認為，一些食品蛋白質(zhì)存在分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)(如二硫鍵、酪氨酸的交聯(lián))，將其加入酶液中會形成類似于保護膜的網(wǎng)絡狀空間結(jié)構(gòu)，包裹酶分子，鎖住一定的水分，盡可能地阻止不良環(huán)境對酶活性的破壞[23]。且有些蛋白質(zhì)(如酪蛋白)可能存在有目標酶的催化底物，會在酶的活性中心附近聚集，形成疏水結(jié)構(gòu)，保護酶的催化活性[17]。此外，小麥蛋白粉中小麥多肽的抗氧化能力也能在一定程度上防止TGase活性中心的巰基被氧化[24]，保護酶的熱穩(wěn)定性。

2.5 氨基酸對TGase熱穩(wěn)定性的影響

目前，常見的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑除了糖類，多元醇，離子化合物，還有一些氨基酸及其衍生物等[25]。這些小分子物質(zhì)作為分子伴侶，在逆境中維持著蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和功能以阻止蛋白質(zhì)的變性?？紤]到不同氨基酸的親水性和疏水性強弱不一，選用了5種氨基酸(精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸)進行研究。由于部分氨基酸在磷酸緩沖液中的溶解度較低，我們只研究了10 g/L的各類氨基酸對TGase熱穩(wěn)定性的影響。圖5顯示各類氨基酸對TGase的保護作用，效果最好的甘氨酸對應的TGaset1/2為14.07 min，同比對照提高44.46%。其他4種氨基酸對TGase的保護性并不明顯，精氨酸的存在還破壞了TGase的熱穩(wěn)定性。研究甘氨酸分子結(jié)構(gòu)可知，甘氨酸的側(cè)鏈是個氫原子，其α-碳上的2個氫原子賦予分子疏水特性，較小的側(cè)鏈使甘氨酸可以填進蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不能容納別的氨基酸的縫隙里[26]，從而有效維持目標蛋白的三維結(jié)構(gòu)不被破壞。但與效果較好的糖、鹽、醇類或蛋白質(zhì)影響下的TGase相比，添加氨基酸的TGase的熱穩(wěn)定性并沒有得到明顯地改善，且大部分氨基酸溶解度較差，價格較為昂貴，不適合在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應用。綜合以上因素，不考慮把氨基酸作為正交試驗的因素。

圖5 氨基酸類對TGase t1/2(55 ℃)的影響Fig.5 The effects of amino acids on t1/2(55 ℃) of TGase

2.6 復合穩(wěn)定劑對TGase熱穩(wěn)定性的影響

2.6.1 復合穩(wěn)定劑的確定

通過對上述的糖類、鹽類、醇類、小麥蛋白和氨基酸進行的單因素實驗，同時考慮穩(wěn)定劑的經(jīng)濟成本以及能否和TGase一起廣泛應用于食品、生物等各領(lǐng)域，選取幾個能明顯改善TGase熱穩(wěn)定性的因素水平，進行正交試驗，并對結(jié)果進行極差分析，以便獲取最佳的穩(wěn)定劑配方。采用L9(34)正交表，以山梨醇(A)、NaCl(B)、葡萄糖(C)、小麥蛋白(D)作為4個考察因素，選取3個水平進行試驗，見表1和表2。

表1 TGase熱穩(wěn)定劑L9(34)正交試驗因素水平表

按表1的正交因素水平設計L9(34)正交試驗，結(jié)果見表2。

表2 TGase熱穩(wěn)定劑L9(34)正交試驗設計及結(jié)果

由表2的極差分析結(jié)果可以看到，RA>RD>RB>RC，4個因素對TGase熱穩(wěn)定性的影響大小依次為：山梨醇(A)>小麥蛋白(D)>NaCl(B)>葡萄糖(C)。在這4個因素中，山梨醇和小麥蛋白的影響較為明顯。在試驗設計的范圍內(nèi)，優(yōu)化TGase熱穩(wěn)定劑最佳組合為A3B3C3D3，即山梨醇50 g/L、小麥蛋白50 g/L、NaCl 50 g/L、葡萄糖50 g/L。對最優(yōu)組合進行3次平行實驗驗證，TGase在55 ℃時的t1/2的平均值為591.49 min，較對照提高59.73倍，高于表2中的每一項試驗結(jié)果，故A3B3C3D3為TGase復合穩(wěn)定劑的最佳配方。

2.6.2 復合穩(wěn)定劑對TGase最適反應溫度的影響

當TGase應用于食品生產(chǎn)領(lǐng)域時，食品的高溫加工工藝會顯著地破壞TGase的酶活，限制其工業(yè)應用范圍。本研究考察了復合穩(wěn)定劑中TGase的最適反應溫度，圖6顯示其最適反應溫度為60 ℃，較對照組提高了10 ℃，有效地改善了TGase在高溫加工應用中的局限性。

圖6 復配穩(wěn)定劑中TGase的最適反應溫度Fig.6 The optimum reaction temperature of TGase in the best compound stabilizer

2.6.3 復合穩(wěn)定劑中TGase在不同溫度下的熱穩(wěn)定性

由圖7可知，隨著處理溫度的升高，酶的活力逐漸下降。對照組在40 ℃甚至更高溫度熱處理后，酶活的衰減速率較實驗組下降更為顯著。60 ℃熱處理1h后，對照組的殘余酶活率已降至0，實驗組仍能維持在42.11%，復合穩(wěn)定劑中的TGase對溫度的耐受性有了較大的改善，有利于延長酶在高溫加工中的應用時間。

圖7 復配穩(wěn)定劑中TGase在不同溫度下的熱穩(wěn)定性Fig.7 The thermal stability of TGase at different temperatures in the best compound stabilizer

2.6.4 復合穩(wěn)定劑中TGase的常溫儲存穩(wěn)定性

成品TGase在常溫儲存期間容易受溫度的影響而逐漸喪失酶活，使其商業(yè)應用價值下降，為此，我們考察了實驗組TGase的常溫儲存穩(wěn)定性。由圖8可知，隨著時間的增加，對照組的酶活下降速率明顯快于實驗組。當常溫存儲80 d后，對照組的殘余酶活率已下降至11%，而實驗組仍能維持在73.84%，有效地延緩了常溫下酶的失活速率，有利于延長成品TGase的貨架期，維持其商業(yè)應用價值。

圖8 復配穩(wěn)定劑中TGase的常溫儲存穩(wěn)定性Fig.8 The room temperature storage stability of TGase in the best compound stabilizer

3 結(jié)論

微生物來源的TGase在保存中容易因各種外在因素而發(fā)生酶失活，溫度對酶活的影響更是限制其應用范圍的關(guān)鍵因素。相較于分子改造的繁瑣和難以工業(yè)化等問題，外源添加廉價、安全的穩(wěn)定劑成為酶制劑領(lǐng)域常用的手段。本實驗研究了糖、鹽和多元醇等對TGase熱穩(wěn)定性的影響，并根據(jù)單因素結(jié)果設計了正交試驗，確定復合穩(wěn)定劑的最佳配方為：山梨醇50 g/L、小麥蛋白50 g/L、NaCl 50 g/L、葡萄糖50 g/L，得到TGase的t1/2為591.49 min，最適反應溫度為60 ℃，分別較對照提高了59.73倍和10 ℃，對不同溫度的耐受性也明顯優(yōu)于對照，常溫存儲80 d后的殘余酶活率仍能維持在73.84%。因此，復配穩(wěn)定劑能較好地改善TGase的熱穩(wěn)定性。目前，諸多的穩(wěn)定劑已被應用于各類酶的逆境穩(wěn)定性研究，雖有一定的穩(wěn)定效果但還遠不能滿足各類工業(yè)應用壞境的需求，對新型穩(wěn)定劑的開發(fā)和研究也鮮有報道。基于此，研究者們可以研究和篩選新型穩(wěn)定劑對TGase穩(wěn)定性的作用效果，以期能不斷優(yōu)化TGase的穩(wěn)定性。

[1] SANTOS M,TORNE J M.Recent patents on transglutaminase production and applications: a brief review[J].Recent Patents on Biotechnology,2009,3(3):166-174.

[2] 葉雙雙,周麗,周哲敏.基于保護劑篩選及優(yōu)化策略提高苯丙氨酸羥化酶熱穩(wěn)定性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(6):56-61.

[3] 童理明.分子改造提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶熱穩(wěn)定性[D].無錫:江南大學,2016:3-7.

[4] 劉中美,坤杜,周哲敏.人工設計二硫鍵增強谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶熱穩(wěn)定性[J].食品與生物技術(shù)學報,2015,34(10):1 057-1 061.

[5] 張春紅,高慧楠,常南,等.以殼聚糖為載體固定化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的研究[J].食品科技,2009,34(12):33-35.

[6] 劉松,堵國成,陳堅.化學修飾提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性與熱穩(wěn)定性[J].食品與生物技術(shù)學報,2015,34(11):1 135-1 140.

[7] SEKIGUCHI S,HASHIDA Y,YASUKAWA K,et al.Stabilization of bovine intestine alkaline phosphatase by sugars[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,2012,76(1):95-100.

[8] BELLUZO S,BOERIS V,FARRUGGIA B,et al.Influence of stabilizers cosolutes on catalase conformation[J].International Journal of Biological Macromolecules,2011,49(5):936-941.

[9] 常忠義,榮紹豐,高紅亮,等.采用TG和DSC方法研究糖類對谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶熱穩(wěn)定性的影響[J].食品科學,2007,28(2):202-205.

[10] SZABO A,KOTORMAN M,LACZKO I,et al.Influence of carbohydrates on stability of papain in aqueous tetrahydrofuran mixture[J].Journal of Chemical Technology and Biotechnology,2009,84(1):133-138.

[11] PAZHANG M,MEHRNEJAD F,PAZHANG Y,et al.Effect of sorbitol and glycerol on the stability of trypsin and difference between their stabilization effects in the various solvents[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2016,63(2):206-213.

[12] KUMAR V,CHARI R,SHARMA V K,et al.Modulation of the thermodynamic stability of proteins by polyols:Significance of polyol hydrophobicity and impact on the chemical potential of water[J].International Journal of Pharmaceutics,2011,413(1-2):19-28.

[13] PETERSEN S B,JONSON V,FOJAN P,et al.Sorbitol prevents the self-aggregation of unfolded lysozyme leading to an up to 13 degrees C stabilisation of the folded form[J].Journal of Biotechnology,2004,114(3):269-278.

[14] 朱懷梅,常忠義,高紅亮, 等.鹽離子對微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶熱穩(wěn)定性的影響[J].云南大學學報(自然科學版),2008,30(S1):426-429.

[15] GROSSOWICZ N,WAINFAN E,BOREK E,et al.The enzymatic formation of hydroxamic acids from glutamine and asparagine[J].Journal of Biological Chemistry,1950,187(1):111-125.

[16] O′FAGAIN C.Enzyme stabilization - recent experimental progress[J].Enzyme and Microbial Technology,2003,33(2-3):137-149.

[17] 彭燦.微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶穩(wěn)定性的研究[D].上海:華東師范大學,2007:46-52.

[18] TIMASHEFF S N.Protein hydration, thermodynamic binding, and preferential hydration[J].Biochemistry,2002,41(46):13 473-13 482.

[19] FERNANDEZ L,GOMEZ L,RAMIREZ H L,et al.Thermal stabilization of trypsin with glycol chitosan[J].Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic,2005,34(1-6):14-17.

[20] COMBES D,MONSAN P.Effect of polyhydric alcohols on invertase stabilization[J].Annals of the New York Academy of Sciences,1984,434:61-63.

[21] 毛新煥,李響,王姍姍,等.辣根過氧化物酶的熱穩(wěn)定劑篩選[J].生物工程學報,2009,25(3):388-391.

[22] 榮紹豐,高紅亮,常忠義,等.一些蛋白質(zhì)和多肽對谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶熱穩(wěn)定性的影響[J].食品工業(yè)科技,2006,27(12):95-97.

[23] 王璋,許時嬰,湯堅.食品化學[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,1999:48-69.

[24] 彭燦,常忠義,王疆元,等.谷朊粉水解物對微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶穩(wěn)定性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版),2007,35(8):171-175.

[25] KUMAR V,SHARMA V K,KALONIA D S.Effect of polyols on polyethylene glycol (PEG)-induced precipitation of proteins: Impact on solubility, stability and conformation[J].International Journal of Pharmaceutics,2009,366(1-2):38-43.

[26] 王希成.生物化學[M].第3版.北京:清華大學出版社,2010:10-16.