HPLC法測定橙子中L-抗壞血酸含量的研究

張曉燕，張立秋，曲平，史曉麗，劉歡，*（.通化師范學院，吉林通化3400；.通化出入境檢驗檢疫局技術中心，吉林通化3400）

橙子，又名“黃果”，為蕓香科植物香橙的果實，含有豐富的維生素C（Vitamin C，VC）[1]。維生素 C 又稱抗壞血酸（Ascorbic Acid），是一種水溶性維生素，對人體有較高的營養(yǎng)價值，是人體所必需的營養(yǎng)素[2]。經(jīng)醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，它可以提高免疫力，保護牙齒、牙齦，減少皮膚中的黑色素沉著，促進傷口愈合，預防癌癥、心臟病、肝硬化、中風等疾病的效果[3]。缺乏時可引起造血機制障礙、貧血、微血管壁通透性增加，脆性增加，容易出血等壞血病癥狀，故其對人體健康有著重要的意義[4]。在人體內(nèi)，維生素C是一種高效的抗氧化劑，能用來減輕抗壞血酸過氧化物酶基底的氧化能力[3]，而且維生素C在食品工業(yè)上常被用作酸味劑、抗氧化劑及強化劑。維生素C在人體內(nèi)不能合成，主要是從膳食中獲取，蔬菜和水果是維生素C的重要來源。而橙子含有豐富的維生素C。因此，測定橙子中的維生素C的含量具有重要的意義。

維生素C有4種異構(gòu)體，即L-抗壞血酸，D-抗壞血酸，L-異抗壞血酸，D-異抗壞血酸[5]。其中以L-抗壞血酸的含量及檢測方法居多，薛剛等[6]用2，4-二硝基苯肼比色法測定嬰兒配方奶粉中L-抗壞血酸的含量；張捷莉等[7]用紫外分光光度法測定維多康中L-抗壞血酸的含量；另外還有使用碘量法[8-9]、熒光法[10-11]等方法進行的檢測。但由于L-抗壞血酸具有較強的還原性，遇熱見光都容易分解，在中性和堿性條件下不穩(wěn)定。這些方法的選擇性較差，檢測方法操作步驟復雜，試劑和試樣溶液不穩(wěn)定、靈敏度偏低、費時等缺點，尤其是顏色深的試樣，其溶液顏色背景干擾大[12]。本研究采用高效液相色譜法測定橙子中L-抗壞血酸的含量，該方法具有快速、高效、靈敏度高等特點。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器和試劑

1.1.1 材料和試劑

橙子：欣明達超市；偏磷酸、磷酸三鈉、草酸、磷酸（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；L-半胱氨酸（分析純）：天津市福晨化學試劑廠；甲醇（色譜純）：Thermo Fisher Scientific；L-抗壞血酸標準品（純度99.9%以上）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器

高效液相色譜儀（LC-20AT型）：日本島津有限公司；電子天平（YP1002）：上海衡際科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（T6新世紀型）：北京普析通用儀器有限責任公司；電子天平（AL104型）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；超聲波清洗器（KQ-100E型）：昆山市超聲儀器有限公司；pH計（PHS-3C型）：上海儀電科學儀器股份有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9101-3S型）：上海三發(fā)科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

1.2.1.1 L-抗壞血酸提取劑的選擇

L-抗壞血酸具有較強的還原性，易受熱、光、空氣等因素影響，但在酸性溶液中卻很穩(wěn)定[13-14]。為防止標準品及樣品中的L-抗壞血酸被氧化分解，本試驗選用草酸溶液、偏磷酸溶液作為提取劑，來提取標準品及樣品中的L-抗壞血酸。使用紫外可見分光光度計分別測定用偏磷酸溶液和草酸溶液做提取劑的樣品的吸光度，由于使用偏磷酸溶液做提取劑樣品的吸光度大于使用草酸溶液做提取劑樣品的吸光度，所以本試驗選擇使用偏磷酸溶液做提取劑。

1.2.1.2 樣品處理

將去除皮的橙子精確稱取20 g加入等質(zhì)量的20 g/L的偏磷酸溶液，在避光的條件下，放入研缽中進行搗碎研磨，研磨充分之后精密稱取均勻樣液6.8 g于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L的偏磷酸溶液震蕩溶解并定容，用濾紙進行過濾，超聲5 min并標記此樣品為樣品1。在樣品1中準確量取20 mL的樣液加入10 mL 10 g/L的L-半胱氨酸溶液，用100 g/L磷酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，超聲10 min，再用85%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.6。用水將溶液全部轉(zhuǎn)移到50 mL棕色容量瓶中，定容至刻度并標記為樣品1-1。從樣品1中準確量取20 mL的樣液用水將樣液全部轉(zhuǎn)移到50 mL棕色容量瓶中，定容至刻度并標記為樣品1-2。在分析前使用0.45 μm濾膜過濾。

1.2.1.3 樣品溶液的選擇

分別精密吸取樣品1-1溶液與樣品1-2溶液10 μL注入高效液相色譜儀進行檢測，觀察樣品溶液的色譜峰面積。結(jié)果表明，調(diào)pH樣液的色譜峰面積大于未調(diào)pH樣液的色譜峰面積。所以本試驗選擇樣品1-1作為樣品溶液。

1.2.2 標準品溶液的制備

精確稱取L-抗壞血酸標準品25 mg放入25 mL的棕色容量瓶中，用20 g/L的偏磷酸溶液震蕩溶解并定容至刻度，配成1 mg/mL的L-抗壞血酸標準品溶液，作為儲備液。依次精密吸取儲備液10、50、100、200、500 μL于10 mL容量瓶中，用20 g/L的偏磷酸溶液稀釋并定容至刻度，配成濃度分別為1、5、10、20、50 μg/mL的L-抗壞血酸標準品溶液。

1.3 色譜條件的選擇

檢測波長的選擇：將配好的L-抗壞血酸標準品溶液用SPD-20A紫外可見檢測器在210 nm～310 nm范圍內(nèi)進行掃描檢測。

流動相比例的選擇：選擇0.05 mol/L磷酸溶液-甲醇為 85∶15、87 ∶13、90∶10、95∶5這 4種配比作為流動相比例，進樣檢測。

柱溫的選擇：分別在20、25、30℃溫度下進行檢測。

流速的選擇：分別以 0.800、1.000、1.200 mL/min的流速進樣檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

經(jīng)過對色譜條件的比較分析得到結(jié)果，檢測波長在245 nm處有最大吸收波長且雜峰干擾較少，基線相對穩(wěn)定。流動相以0.05 mol/L磷酸溶液-甲醇（90∶10）的配比時出峰時間較短，出峰型較好。柱溫的改變對于色譜峰的出峰時間和峰型沒有明顯變化，但實驗室的室溫接近25℃。流速過快出峰的時間較早，與溶劑峰比較接近，故選0.800 mL/min。確定本試驗的色譜條件為檢測波長：245 nm；流動相比例：0.05 mol/L磷酸溶液-甲醇（90 ∶10）；柱溫：25℃；流速：0.800 mL/min。

2.2 定性分析

分別精密吸取溶劑、L-抗壞血酸標準品溶液、樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，進行檢測，根據(jù)出峰時間進行定性分析，結(jié)果如圖1。

圖1 溶劑、標準品及樣品色譜圖Fig.1 The chromatograms of solvent，standard substance and sample

由圖1可知，L-抗壞血酸標準品溶液色譜峰出峰在4.835 min，樣品溶液色譜峰出峰在4.829 min，溶劑在該時間段沒有色譜峰，可以確定樣品溶液中含有L-抗壞血酸。

2.3 標準曲線的繪制

L-抗壞血酸標準品溶液用0.45 μm濾膜過濾后，分別取不同濃度的L-抗壞血酸標準品溶液10 μL，將標準品溶液逐次進樣分析，測定不同濃度的L-抗壞血酸標準品溶液濃度所對應的峰面積。以L-抗壞血酸標準品溶液濃度（μg/mL）為橫坐標x，相對應的峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。得線性回歸方程：Y=60 408.6x+38 583.7，相關系數(shù)：R2=0.999 6（n=5）。結(jié)果表明 L（+）-抗壞血酸濃度在 1μg/mL～50μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關系。以2倍基線噪聲所對應的濃度計算本方法的檢出限，L（+）-抗壞血酸的檢出限為0.5 μg/mL。標準曲線如圖2所示。

圖2 標準曲線圖Fig.2 Figure of standard curve

2.4 精密度試驗

精密吸取L-抗壞血酸標準品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進樣6次進行檢測，得到的色譜峰面積分別為 6 125 033、6 162 932、6 181 420、6 192 873、6 201 210、6 250 472。如表1所示。

表1 精密度測定結(jié)果Table 1 Determined results of precision

根據(jù)表1得出峰面積的相對標準偏差RSD＝0.67%，試驗結(jié)果表明該方法測定結(jié)果的精密度良好。

2.5 樣品含量測定

精密吸取樣品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，測得色譜峰面積為1 170 272，根據(jù)標準曲線進行定量分析，L-抗壞血酸的濃度為18.734 μg/mL，以外標法計算含量，結(jié)果得樣品溶液中L-抗壞血酸的含量為68.88 mg/100 g。

2.6 重現(xiàn)性試驗

將同一樣品進行3次平行試驗，按1.2.1.2處理后按照上述所設定的色譜檢測條件進行檢測，3次檢測的峰面積分別為120 823、121 701、124 915，計算得到樣品中含有L-抗壞血酸的濃度分別為1.36、1.38、1.43 μg/mL，通過計算相對標準偏差RSD=1.76%，結(jié)果說明本試驗所采用的方法準確度較高。

2.7 穩(wěn)定性試驗

將樣品溶液分別于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 h精密吸取10 μL注入液相色譜儀進行測定。結(jié)果表明，L-抗壞血酸的色譜峰在8 h內(nèi)比較穩(wěn)定，9 h之后L-抗壞血酸標準品溶液的色譜峰峰型發(fā)生改變，說明L-抗壞血酸在8 h之內(nèi)比較穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗采用高效液相色譜法測定橙子中L-抗壞血酸的含量。根據(jù)定性分析試驗可以確定4.829 min處出現(xiàn)的色譜峰為L-抗壞血酸的特征色譜峰。以不同濃度L-抗壞血酸標準品獲得標準曲線Y=60 408.6x+38 583.7，線性相關系數(shù) R2=0.999 6（n=5），在 1 μg/mL～50 μg/mL范圍內(nèi)L-抗壞血酸具有良好的線性關系。檢出限為0.5 μg/mL，試驗方法較為靈敏。連續(xù)6次進樣測得精密度的相對標準偏差RSD=0.67%，試驗色譜條件精密度良好。3次平行試驗獲得的相對標準偏差RSD=1.76%，重現(xiàn)性良好，采用的試驗方法準確度較高。穩(wěn)定性試驗表明L-抗壞血酸在8 h內(nèi)比較穩(wěn)定。測得樣品溶液中L-抗壞血酸的含量為68.88 mg/100 g。從樣品的色譜圖可知，該方法分析L-抗壞血酸的含量大約需要5 min，具有快速的特點，且本試驗方法無需特殊試劑、操作簡便，可減少L-抗壞血酸的損失。本試驗方法也可以為其它蔬菜和水果中L-抗壞血酸含量的檢測提供參考。

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