茉莉酸甲酯誘導(dǎo)桉樹對焦枯病的抗性研究

郭朦朦，陳慧潔，馮麗貞，楊澤慧，陸 芝，唐 芬

(福建農(nóng)林大學 林學院，福建 福州 350002)

桉樹(Eucalyptusspp.)是世界三大速生造林樹種之一[1]。桉樹焦枯病(Cylindrodadiumleaf blight)是一種世界性病害，嚴重危脅桉樹生產(chǎn)[2]。如今生產(chǎn)上對桉樹焦枯病的防治主要采取化學防治，但因森林面積大，森林病害具有長時性和隱蔽性，采用化學防治不符合社會經(jīng)濟的實際情況，不僅收效甚微，而且導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、污染環(huán)境[3]。同時藥物的重復(fù)使用使病菌產(chǎn)生抗藥性，其防治效果大大下降[4]。因此,為促進林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，從植物的抗病防御機制入手，提高寄主抗病性是桉樹焦枯病防治切實可行的重要途徑。

茉莉酸甲酯(MeJA)是新確認的一種植物體的植物生長物質(zhì)，其生理功能與植物體的抗病防御系統(tǒng)有關(guān)，在病蟲害防御等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起信使作用[5-11]，且MeJA具有高效、對環(huán)境無毒害、操作簡單等特點。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)不同抗病種系桉樹的SOD活性、PPO活性及其同工酶譜均可作為早期鑒定桉樹對焦枯病抗病性的重要生理生化指標[12]；在構(gòu)建抗病種系“巨赤桉9224”(Eucalyptusgrandis×E.tereticornisM1)在焦枯病菌(C.quinqueseptatumMorgan)侵染下的cDNA正向差減文庫上調(diào)表達基因中發(fā)現(xiàn)茉莉酸結(jié)構(gòu)域mRNA[13]；用桉樹焦枯病菌Ca.pseudoreteaudii侵染抗病種系“尾細桉M1”后，其蛋白組和表達譜分析也表明茉莉酸(JAs)生物合成相關(guān)基因上調(diào)表達[12]。前期的這些研究都暗示了JAs信號途徑參與了桉樹對焦枯病菌的響應(yīng)。由于桉樹焦枯病主要為害桉樹幼苗和4 a生以下桉樹幼林。因此，本試驗以前期研究的11個桉樹主栽種系中感病品種“巨桉3號”和中抗品種“巨尾桉廣9”的組培苗為試驗材料，通過檢測MeJA誘導(dǎo)抗病性弱的桉樹后體內(nèi)抗病防御酶應(yīng)答，篩選出MeJA誘導(dǎo)桉樹對焦枯病抗性的最佳濃度及抗性的持效期，為桉樹焦枯病防治工作提供理論和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

感病種系“巨桉3號”(Eucalyptusgrandis3) 和中抗種系“巨尾桉廣9”(E.grandis3×E.urohyllaguang 9)組培苗為材料[14]，于2012年5月取發(fā)育正常、無病害癥狀、苗高20 cm左右的組培苗移植于福建農(nóng)林大學森林保護研究所試驗地，株行距為30 cm×40 cm，確保苗木生長健康，2個月后用于試驗。

1.2 供試病原菌

強致病力焦枯病菌Ca.pseudoreteaudii[15]由福建農(nóng)林大學森林保護研究所提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 茉莉酸甲酯對焦枯病菌的毒性檢測 采用抑菌圈法[16]。取0.1 mL濃度為106個/mL的焦枯病菌懸浮液于PDA培養(yǎng)基上(d=9 cm)，均勻涂抹。待表面無液滴后，將浸有不同濃度MeJA(0.05,0.1,0.5,1 mmol/L)的圓形濾紙片(d=6 mm)放入培養(yǎng)皿中，以浸有無菌水的濾紙片為對照，每個培養(yǎng)皿同時放入同一濃度的圓形濾紙片3片，每濃度重復(fù)3次。在25 ℃下培養(yǎng)72 h后觀察記錄濾紙片圓片周圍抑菌圈的有無及大小。

1.3.2 茉莉酸甲酯處理及接菌 接菌前3 d，用0(Control)，0.05，0.1，0.5，1 mmol/L的MeJA(內(nèi)含0.1%的Tween20)進行葉面噴施處理，植株下面的土壤用聚乙烯塑料覆蓋，每天噴霧1次，以看到液滴從葉面滴落為止，連續(xù)3次后，用濃度為5×104個/mL的孢子懸浮液進行無傷接種，同時用無菌水濕棉球保濕，外面覆蓋透明塑料薄膜。接種后24 h[14]取成熟度一致的植株頂部第一完全展開葉片用于SOD和PPO活性的測定。

1.3.3 茉莉酸甲酯對焦枯病抗性的測定 用1.3.2中篩選出的最適MeJA誘導(dǎo)濃度對“巨桉3號”和“巨尾桉廣9”進行葉面噴施處理，在處理后的1，3，5，7，10和15 d，用濃度為5×104個/mL的孢子懸浮液進行無傷接種，每次接種24 h后，取成熟度一致的植株頂部第一完全展開葉片用于SOD和PPO活性測定。

1.3.4 多酚氧化酶和超氧化物歧化酶活性的測定 多酚氧化酶(PPO)采用三氯乙酸比色法[17]。超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑(NBT)光還原法[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2003軟件處理數(shù)據(jù)并作圖，用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯對焦枯病菌菌落生長情況的影響

在浸有0.05,0.1,0.5,1 mmol/L MeJA濃度的濾紙片圓片周圍無明顯抑菌圈形成(圖1)，可以得出，不同濃度的MeJA對桉樹焦枯病菌的生長無明顯的直接毒性。

a，b，c，d和e分別代表對照組，0.05 mmol/L，0.1 mmol/L，0.5 mmol/L和1 mmol/L MeJA濃度a,b,c,d and e stand for control,0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,0.5 mmol/L and 1 mmol/L of MeJA respectively圖1 茉莉酸甲酯對焦枯病菌菌落生長情況的影響Fig.1 Toxicity assay of different concentrations of MeJA to Ca. pseudoreteaudii

2.2 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后接種焦枯病菌對PPO活性的影響

圖2顯示，不同濃度MeJA誘導(dǎo)不同抗病類型桉樹后，其葉片的PPO活性均隨MeJA濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢，當濃度為0.1 mmol/L時，PPO活性最高。從圖2還可看出，感病種系“巨桉3號”誘導(dǎo)前PPO活性比中抗種系“巨尾桉廣9”低，這與課題組前期研究結(jié)果一致[19]，但低濃度MeJA誘導(dǎo)后PPO活性增幅“巨桉3號”均高于“巨尾桉廣9”，“巨桉3號”分別比對照高出35.1%、90.3%和47.4%，而“巨尾桉廣9”才高出21.9%、45.5%和13.4%；高濃度(1 mmol/L)的MeJA使PPO活性下降，并低于誘導(dǎo)前，分別比對照降低了18.2%和4.8%。可見，不同濃度MeJA對桉樹抗病性誘導(dǎo)的效果不同，低濃度MeJA感病種系“巨桉3號” 誘導(dǎo)效果比中抗種系“巨尾桉廣9”好。

圖2 不同濃度MeJA處理后接種焦枯病菌時桉樹葉片的PPO活性變化Fig.2 The PPO activity change in eucalyptus leaves after inducing with different concentrations of MeJA for 3 days and then inoculating Ca. pseudoreteaudii

圖3 不同濃度MeJA處理后接種焦枯病菌時桉樹葉片的SOD活性變化Fig.3 The SOD activity change in eucalyptus leaves when induced with different concentrations of MeJA for 3 days and then inoculated Ca. pseudoreteaudii

2.3 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后接種焦枯病菌對SOD活性的影響

不同濃度MeJA誘導(dǎo)并接種焦枯病菌后，“巨桉3號”和 “巨尾桉廣9”葉片SOD活性變化趨勢與PPO活性變化趨勢基本一致，如圖3所示。只是酶活性增幅更高。MeJA從低到高各濃度誘導(dǎo)，“巨桉3號” SOD活性比對照相分別為增長了47.9%、112.9%和37.9%，而“巨尾桉廣9”為28.1%、63.7%和34.5%，當濃度為1 mmol/L時，“巨桉3號” 和“巨尾桉廣9”的SOD活性最低，分別比對照下降了7.9%和9.4%。進一步驗證了低濃度MeJA能誘導(dǎo)桉樹對焦枯病的抗性，且最佳濃度為0.1 mmol/L，同時感病種系“巨桉3號” 誘導(dǎo)效果強于中抗種系“巨尾桉廣9”。

2.4 0.1 mmol/L MeJA誘導(dǎo)后不同時間接種對桉葉PPO活性的影響

從圖4中可以看出，“巨桉3號”和 “巨尾桉廣9” 經(jīng)最適濃度0.1 mmol/L MeJA誘導(dǎo)后在1、3、5、7、10和15 d不同時間接種葉片的PPO活性都有提高，到第5天時達到最大值，與第1天相比分別高出76%和67.5%。隨后兩品種的酶活性逐漸下降，但均高于第1天?！熬掼?號”第7～10天略有回升，隨后又開始下降，到第15天時，酶活性略高于第1天?？傊熬掼?號”誘導(dǎo)后的PPO活性高于“巨尾桉廣9”。

2.5 0.1 mmol/L MeJA誘導(dǎo)后不同時間接種對桉葉SOD活性的影響

經(jīng)最適濃度誘導(dǎo)后不同時間接種“巨桉3號”和 “巨尾桉廣9”葉片SOD活性變化趨勢與PPO活性變化趨勢基本一致(圖5)，呈先上升后下降的趨勢，并都于第5天時酶活性達到最大值，與第1天相比分別高出98.6%和70.5%，均達到顯著水平；而后，兩者的酶活性開始下降，至第15天時，“巨桉3號”和 “巨尾桉廣9”的酶活性分別降至20.2 U/(g·min)和16.9 U/(g·min)，但仍高于第1天。這進一步驗證了MeJA誘導(dǎo)桉樹對焦枯病抗性的最佳表達為誘導(dǎo)后第5天，且其對感病種系“巨桉3號” 的誘導(dǎo)效果較中抗種系“巨尾桉廣9”的好。

圖4 最適濃度MeJA誘導(dǎo)后不同時間接種焦枯病菌下桉樹葉片的PPO酶活性變化Fig.4 The PPO activity change in eucalyptus leaves when induced with the optimal concentration of MeJA for 1,3,5,7,10 and 15 d respectively then inoculated Ca. pseudoreteaudii

圖5 最適濃度MeJA誘導(dǎo)后不同時間接種焦枯病菌下桉樹葉片的SOD酶活性變化Fig.5 The SOD activity change in eucalyptus leaves when induced with the optimal concentration of MeJA for 1,3,5,7,10 and 15 d respectively then inoculated Ca. pseudoreteaudii

3 結(jié)論與討論

茉莉酸類化合物是存在植物體中的一類內(nèi)源的植物生長物質(zhì)[10-11]。茉莉酸甲酯能調(diào)節(jié)植物體抗氧化酶系統(tǒng)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)及次生物質(zhì)合成，提高植物的抗病蟲害性[20]。馮麗貞等[19,21]對福建省11個不同抗病類型桉樹主栽種系研究發(fā)現(xiàn)，無論健康葉還是接種后的病葉，多酚類物質(zhì)含量、黃酮類化合物含量、多酚氧化酶活性、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的水平可作為桉樹對焦枯病抗病性的早期鑒定的生化指標。本研究對感病種系“巨桉3號”和中抗種系“巨尾桉廣9”葉片噴施不同濃度的MeJA誘導(dǎo)后接種焦枯病菌，發(fā)現(xiàn)除高濃度MeJA(1 mmol/L)外，其余各濃度處理的桉樹葉片中超氧化物歧化酶、多酚氧化酶活性均隨MeJA濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢，且都在濃度為0.1 mmol/L處達到最大值；用該濃度處理不同抗病類型的桉葉并間隔不同時間接種后發(fā)現(xiàn)，桉葉的防御反應(yīng)變化與接種時間間隔有關(guān)，且在第5天時多酚氧化酶和超氧化物歧化酶的酶活性最高，隨后呈現(xiàn)出下降的變化趨勢，表明誘導(dǎo)桉樹對焦枯病抗性的最佳表達為誘導(dǎo)后第5天。該結(jié)果顯示低濃度MeJA能夠誘導(dǎo)桉樹抗病保護酶活性的表達，有效地抑制焦枯病菌對桉樹的侵害，從而提高桉樹對焦枯病抗性。

植物抗性分為基礎(chǔ)抗性和誘導(dǎo)抗性，基礎(chǔ)抗性是由遺傳決定的。因此，誘導(dǎo)系統(tǒng)性抗性是植物的一種重要防病機制，對于生長性狀優(yōu)良但感病的桉樹無性系來說，利用誘導(dǎo)抗性大幅度地提高其對于焦枯病的抗性、降低發(fā)病程度、減少死亡或生長損失無疑是一條強有力的控制病害途徑。本研究結(jié)果顯示，茉莉酸甲酯對桉樹焦枯病菌沒有直接毒性，MeJA在植物抗病中的主要作用不是直接的抑菌作用，而是誘導(dǎo)刺激植物防御系統(tǒng)表達，以防止焦枯病菌對桉樹的侵害，且誘導(dǎo)的最佳濃度為0.1 mmol/L，最佳表達為誘導(dǎo)后第5天。更可喜的是感病種系“巨桉3號”所表現(xiàn)出的誘導(dǎo)效果比中感種系“巨尾桉廣9”更佳，這無疑給生產(chǎn)實踐帶來福音。

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