氟苯尼考浸泡櫛孔扇貝后各組織中含量的測(cè)定?

周飛飛, 李志林, 蘇榮國(guó)??, 石曉勇, 韓秀榮

(1.中國(guó)海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100； 2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 3.國(guó)家海洋局海洋減災(zāi)中心, 北京 100194)

氟苯尼考(Florfenicol)又名氟甲砜霉素，其化學(xué)名稱為D (+)-蘇-1-對(duì)甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇，是一種新型的氯霉素類廣譜抗菌藥[1-2]。該抗生素藥具有抗菌譜廣、吸收良好、體內(nèi)分布廣、安全高效等特點(diǎn)，對(duì)敏感菌所致的畜禽細(xì)菌性疾病治療效果顯著，特別是毒副作用顯著降低[3]。因此, 氟苯尼考自1990年代引進(jìn)以來廣泛用于水產(chǎn) 、禽類等動(dòng)物的細(xì)菌性疾病防治。

近年來隨著食品安全問題日益突出，對(duì)以氟苯尼考為代表的抗生素類藥物的研究受到越來越多的重視，研究氟苯尼考在水生生物體內(nèi)代謝消除規(guī)律,評(píng)估其在生物體內(nèi)的蓄積及毒性，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)科學(xué)施藥具有重要的指導(dǎo)意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于氟苯尼考研究主要集中在魚類、蟹類、蝦類等動(dòng)物[4-6]，對(duì)于扇貝的研究未見正式報(bào)道。櫛孔扇貝(Chlamysfarreri,)是北方沿海地區(qū)主要的海水養(yǎng)殖貝類之一，由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，成為我國(guó)重要的漁業(yè)資源之一。本文以櫛孔扇貝為對(duì)象，研究其不同組織對(duì)氟苯尼考的蓄積與消除規(guī)律，以期在櫛孔扇貝養(yǎng)殖中合理施用氟苯尼考提供參考。

1 材料與方法

1.1 櫛孔扇貝

櫛孔扇貝由青島沙子口養(yǎng)殖場(chǎng)提供，平均殼長(zhǎng)(6.0±0.5)cm，在玻璃培養(yǎng)箱進(jìn)行暫養(yǎng)，時(shí)間為7天。所使用海水的pH在8左右，溫度25 ℃左右，鹽度為32。暫養(yǎng)期間每天定時(shí)換清潔海水1次,并且定時(shí)投餌，死亡率低于5%后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，北京百靈威科技有限公司)、氟苯尼考粉(上海華南動(dòng)物藥品有限公司)、乙腈(色譜純，德國(guó)Merck Drugs & Biotechnology)，己烷、甲醇、乙酸乙酯、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均由上海國(guó)藥有限公司提供的分析純?cè)噭?，海水采自青島市沙子口附近海域。

1.3 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(Agela, LC-10F)、高速離心機(jī)(德國(guó)，sigma)、高速冷凍干燥機(jī)(美國(guó)金西盟國(guó)際集團(tuán))、超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技有限公司)、C18-SPE柱(迪馬科技)、氮?dú)獯蹈蓛x(上海旌派儀器有限公司)、電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn) 先將氟苯尼考原粉按10、100、1 000和5 000 mg·L-1的劑量配制溶液，設(shè)置3個(gè)對(duì)照組，每組放置10只櫛孔扇貝，根據(jù)24 h的死亡率估計(jì)半致死濃度可能范圍。試驗(yàn)期間不進(jìn)行投喂。

正式實(shí)驗(yàn) 用少量分析純甲醇將氟苯尼考原粉溶解配制成母液。由于預(yù)實(shí)驗(yàn)中100 mg·L-1溶液中櫛孔扇貝的24 h死亡率為0，5 000 mg·L-1的24 h死亡率為100%，所以在這兩者的濃度范圍內(nèi)設(shè)置濃度梯度。用海水稀釋母液配成6個(gè)濃度梯度組，分別為0、300、600、1 200、2 400和4 800 mg·L-1，經(jīng)液相色譜測(cè)得5個(gè)濃度梯度有效含量為0、61.8、123.9、247.0、494.4和988.8 mg·L-1(分析方法見1.4.5，后面涉及的濃度均為有效濃度)，每組設(shè)置3個(gè)平行組，每組放置10只櫛孔扇貝。分別記錄每天的死亡個(gè)數(shù)(玻璃棒輕觸無反應(yīng)即可定為死亡)。連續(xù)觀測(cè)96 h，期間不進(jìn)行投食，用SPSS11.5對(duì)急性毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸法分析[7-8]，計(jì)算出半致死濃度LC50以及安全濃度和區(qū)間估值。

1.4.2 氟苯尼考在櫛孔扇貝體內(nèi)蓄積實(shí)驗(yàn) 將櫛孔扇貝分別暴露于氟苯尼考安全濃度以上(A組，40 mg·L-1)、安全濃度水平(B組，20 mg·L-1(見2.1部分))和安全濃度以下(C組，10 mg·L-1)的海水中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照組，每組放置50只櫛孔扇貝，培養(yǎng)條件與暫養(yǎng)條件保持一致，每24h換一次水。分別在1、2、4、6、8天的20:00在每個(gè)培養(yǎng)箱內(nèi)隨機(jī)選取2只櫛孔扇貝進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)，取出櫛孔扇貝的閉殼肌、外套膜、內(nèi)臟團(tuán)，-20℃冷凍保存。

生物對(duì)污染物的蓄積能力通常用生物蓄積系數(shù)[9],即BCF(Bioconcentration factors)表示，BCF值越大，生物對(duì)該污染物的蓄積能力越強(qiáng)，BCF按下式計(jì)算。

式中：Ck和Cw分別為污染物在生物體內(nèi)和水體中的含量(mg·kg-1)。

1.4.3 氟苯尼考在櫛孔扇貝體內(nèi)的消除實(shí)驗(yàn) 蓄積實(shí)驗(yàn)第9天，從上述培養(yǎng)箱中分別取出15只櫛孔扇貝，放置于潔凈海水中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與暫養(yǎng)條件保持一致，分別于9、10、11、13和15天的20:00在每個(gè)培養(yǎng)箱中分別取出櫛孔扇貝進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)，之后在-20℃下冷凍。

1.4.4 樣品處理

步驟1 將冷凍的樣品放于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干48h，在天平上稱量，記錄干重，并將樣品研磨至粉末狀。

步驟2 準(zhǔn)確稱取0.20 g的樣品，加入5 mL的乙酸乙酯，震蕩10 min之后，超聲25 min，以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，再以3mL的乙酸乙酯重復(fù)提取，合并2次的上清液。

步驟3 置于40 ℃氮吹儀上吹干，加入8 mL的磷酸鹽緩沖液(K2HPO4-KH2P04，pH=6.0)，震蕩溶解20 min。加入2×5 mL正己烷振動(dòng)去脂，以6 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心10 min后，棄去上清液[10-11]。

步驟4 將提取液以不超過2 mL·min-1的速度通過SPE柱，減壓抽干5 min，以6 mL甲醇洗脫，洗脫液于40 ℃下氮吹至干，以流動(dòng)相定容1 mL。溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，待測(cè)[12]。

1.4.5 液相色譜分析方法 色譜柱：Agilent PLRP-S 100A C18(5μm 150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：v乙睛∶v水=1∶3;流速:1.0 mL·min-1;波長(zhǎng):225nm; 柱溫:35 ℃，進(jìn)樣量:25 μL。

1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和回收率計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及工作液的配制:分別準(zhǔn)確稱取0.010 0 g氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品于1L容量瓶中，用20%乙睛水溶液溶解并定容至刻度，配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0℃條件下保存。使用時(shí)用20%乙睛水稀釋，配制成不同劑量濃度的溶液，濃度分別為1、0.5、0.1、0.05和0.01 mg·L-1。在HPLC上測(cè)定出各個(gè)劑量濃度對(duì)應(yīng)的峰面積，以氟苯尼考峰面積為縱坐標(biāo), 劑量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線, 求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

在不含氟苯尼考的櫛孔扇貝的外套膜、內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌中分別添加10.00、2.00和0.50 mg的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，配制3份平行樣。24 h后按1.4.4中第1～4步驟處理樣品，測(cè)定并計(jì)算回收率。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 96 h LC50以及安全濃度

櫛孔扇貝在給藥后的試驗(yàn)過程中，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)頻率低，行動(dòng)遲緩臨床癥狀，嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)開口不閉合，對(duì)外界刺激逐漸無反應(yīng)直至死亡。96 h櫛孔扇貝的死亡率與氟苯尼考濃度對(duì)數(shù)的線性回歸方程為:y=0.606 2x-1.306 2(y為96 h櫛孔扇貝的死亡率，x為氟苯尼考濃度對(duì)數(shù))R2=0.982 4，表明櫛孔扇貝的96 h的死亡率和氟苯尼考濃度對(duì)數(shù)具有較好的相關(guān)性。

經(jīng)SPSS11.5計(jì)算得氟苯尼考對(duì)櫛孔扇貝的96 h LC50=213.1 mg·L-1，95%置信度區(qū)間為127.4～284.6 mg·L-1，根據(jù)表1的魚藥毒性分類標(biāo)準(zhǔn)[13]，可知氟苯尼考對(duì)櫛孔扇貝的毒性為中等毒性。利用公式 SC=96h LC50×0.1[14]計(jì)算得到安全濃度為21.31 mg·L-1。

氟苯尼考對(duì)不同水生生物之間的毒性存在較大的差異，其中，徐力文等[15]報(bào)道氟苯尼考對(duì)雜色鮑(Haliotisdiversicolor)的96h LC50為163 mg·L-1，與本文得到的氟苯尼考對(duì)櫛孔扇貝的毒性相仿。Williams等[16]研究發(fā)現(xiàn)南美白對(duì)蝦(PenaeusvannameiBoone)幼體經(jīng)氟苯尼考溶液24 h浸泡24 h LC50為64 mg·L-1，表現(xiàn)出了較大的毒性。而遲吉祥等[17]測(cè)得氟苯尼考對(duì)四角蛤蜊稚貝(Mactraveneriformis)的96 h LC50為948.64 mg·L-1，對(duì)藍(lán)鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)和虹蹲(Oncorhynchusmykiss)96h LC50分別大于830和780 mg·L-1[18]，則表現(xiàn)出了較低毒性。

表1 魚藥分類等級(jí)Table 1 The classification of toxicity of fish medicine

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜信息、標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率、精密度

氟苯尼考含量測(cè)定使用高效液相色譜儀，圖1為加標(biāo)櫛孔扇貝樣品中氟苯尼考高效液相色譜圖。由圖1可見，氟苯尼考保留時(shí)間為10.297 min，譜峰前后樣品基體干擾較少。

圖1 加標(biāo)櫛孔扇貝外套膜樣品中氟苯尼考色譜圖Fig.1 The spectrogram of the mantle of Chlamys farreri which was added to standard substance of florfenicol

氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=46 404X(Y-歸一化峰面積,X-氟苯尼考濃度)，擬合度為R2=0.999 2，線性范圍為0.01～10 mg·kg-1。各個(gè)組織的回收率為82.0%～104.3%，RSD(Relative standard deviation)范圍為1.6%～9.3%，標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明本測(cè)定方法重復(fù)性良好，符合低濃度檢測(cè)方法重現(xiàn)性的要求。以信噪比(S/N)為3作為確定方法定量檢出限標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得本方法對(duì)氟苯尼考的檢出限為7.0 μg·kg-1，因此該方法能夠滿足水產(chǎn)品中氟苯尼考?xì)埩袅康臏?zhǔn)確測(cè)定。

2.3 櫛孔扇貝各組織對(duì)氟苯尼考的蓄積

A、B、C三組櫛孔扇貝的外套膜、內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌對(duì)組織內(nèi)氟苯尼考蓄積情況分別如圖2、3、4所示，表3為蓄積階段各組織、各組的最大BCF值。

如圖2所示，累積過程中，A組、B組和C組櫛孔扇貝外套膜中氟苯尼考含量均在第1天迅速上升，分別達(dá)到5.57×10-4、3.93×10-4和1.18×10-4g·kg-1。在隨后的3天內(nèi)外套膜內(nèi)氟苯尼考的含量逐步下降。在第4天后氟苯尼考含量又呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，并于第8天蓄積結(jié)束的時(shí)候達(dá)到峰值，此時(shí)外套膜內(nèi)的氟苯尼考含量達(dá)到蓄積的最大值，分別為6.68×10-4、4.01×10-4和2.15×10-4g·kg-1。由圖2與表3可知，3組外套膜中生物蓄積系數(shù)BCF均在第8天達(dá)到最大值，且其值均小于0.01，表明櫛孔扇貝外套膜對(duì)氟苯尼考的蓄積能力較小，且隨著水體氟苯尼考濃度增加，BCF減小，如C組的BCF最大值分別是B組和A組最大值的1.07倍和1.29倍。

表2 氟苯尼考測(cè)定的回收率和精密度Table 2 The results of recovery and precision of determination of florfenicol

Note：①Supplementation levels；②Mantle；③Visceral mass；④Adductor muscle；⑤Percent recovery

圖2 不同氟苯尼考濃度下櫛孔扇貝外套膜的蓄積曲線

圖3 不同氟苯尼考濃度下櫛孔扇貝內(nèi)臟團(tuán)的蓄積曲線

圖4 不同氟苯尼考濃度下櫛孔扇貝閉殼肌的蓄積曲線

生物蓄積系數(shù)①A組②B組③C組④外套膜⑤0.01670.02000.0215內(nèi)臟團(tuán)⑥0.02140.02930.0429閉殼肌⑦0.00620.00760.0115

Note：①Bioconcentration factors；②Group A；③Group B；④Group C；⑤Mantle；⑥Visceral mass；⑦Adductor muscle

從圖3可以看出，內(nèi)臟團(tuán)中氟苯尼考含量第1天快速上升，A、B、C組分別達(dá)到8.55×10-4、5.86×10-4和2.60×10-4g·kg-1，在第2～4天期間氟苯尼考含量逐步下降，從第5天開始氟苯尼考含量又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，到第8天達(dá)到峰值，3組氟苯尼考濃度分別為6.68×10-4、5.59×10-4和4.29×10-4g·kg-1。各組內(nèi)臟團(tuán)的BCF值最大值分別在第1、1和8天取得，同樣也是C組的BCF值最大，分別是B組的1.46倍和A組的2.00倍。

由圖4可知，閉殼肌中氟苯尼考含量變化趨勢(shì)與外套膜和內(nèi)臟團(tuán)相同，同樣在第1天達(dá)到一個(gè)峰值，A、B、C組氟苯尼考濃度分別為2.49×10-4、1.53×10-4和1.15×10-4g·kg-1。其后，A組在第2～4天期間逐步下降，于第4天后開始逐漸升高；B、C兩組在第2～5天期間氟苯尼考含量逐漸下降，第6天起重新出現(xiàn)升高趨勢(shì)，3組均于蓄積過程最后一天也就是第8天達(dá)到峰值，3組氟苯尼考濃度分別為1.53×10-4、0.68×10-4和0.31×10-4g·kg-1。A、B、C組第1天的BCF達(dá)到最大，此時(shí)C組的BCF值同樣明顯高于A組和B組，為A組的1.85倍和B組的1.5倍。

而將富集過程中A組、B組和C組櫛孔扇貝同一組織(外套膜、內(nèi)臟團(tuán)和閉殼肌)中氟苯尼考含量分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示在95%的置信水平下3組之間均存在顯著性差異(P<0.01)，表明環(huán)境中氟苯尼考含量對(duì)其在各組織中的吸收有較大的影響?？傮w而言，蓄積過程中隨著海水中氟苯尼考濃度升高，櫛孔扇貝各組織中的氟苯尼考含量也相應(yīng)的增大，但BCF值卻隨之而下降。任加云等[19]在研究櫛孔扇貝中的石油烴蓄積規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，石油烴濃度越高，BCF越小，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。這表明低濃度條件下，櫛孔扇貝更容易對(duì)氟苯尼考產(chǎn)生蓄積作用。各組織BCF值均很低，說明櫛孔扇貝對(duì)氟苯尼考的蓄積能力較差。余培建等[20]和岳剛毅等[21]在歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)等水生生物體內(nèi)氟苯尼考代謝規(guī)律研究中發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考在生物體內(nèi)的蓄積速度和蓄積量均很低，與本實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果一致。

氟苯尼考在櫛孔扇貝各組織中蓄積隨時(shí)間的變化趨勢(shì)具有相似性，這種變化趨勢(shì)與劉麗娟等在研究撲草凈在菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)的蓄積規(guī)律時(shí)的發(fā)現(xiàn)一致，均表現(xiàn)為：第一階段氟苯尼考含量先較快升至最高值，隨后迅速降低；第二階段降低到一定濃度水平后再次上升至一個(gè)高點(diǎn)[22]。出現(xiàn)第一階段變化趨勢(shì)的可能原因：一是水中顆粒態(tài)氟苯尼考是櫛孔扇貝主要的攝食對(duì)象，起始階段，櫛孔扇貝攝食了大量的氟苯尼考顆粒而導(dǎo)致內(nèi)臟團(tuán)中氟苯尼考的含量在第1天迅速升高，隨著食物的消化排出和由水中氟苯尼考含量降低而導(dǎo)致的櫛孔扇貝對(duì)氟苯尼考顆粒攝入減少，使得內(nèi)臟團(tuán)中氟苯尼考在2～3天時(shí)快速下降。對(duì)于外套膜而言，帶有氟苯尼考顆粒的海水通過外套膜間的空隙進(jìn)入體內(nèi)，由于通道狹小故水流減緩，較大較重的顆粒由于重力作用掉落到外套膜上。同時(shí)，到達(dá)鰓的表面的顆粒經(jīng)鰓絲過濾并運(yùn)送至狹小的食物運(yùn)送溝，在此，較大較重的顆粒也從溝中脫落掉到外套膜上，雖然外套膜上的纖毛會(huì)將脫落的顆粒運(yùn)送到殼口排出，但外套膜上終會(huì)有一部分顆粒，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)前期外套膜的蓄積出現(xiàn)相同的變化。閉殼肌只是關(guān)閉貝殼的作用，不參與攝食與消化，但前期攝入大量的氟苯尼考顆粒會(huì)導(dǎo)致血液中的濃度升高，從而引起閉殼肌中的高峰，但升高的程度比直接參與攝食的器官要低很多。二是起始階段，櫛孔扇貝各組織逐漸吸收氟苯尼考，隨著暴露時(shí)間增加，櫛孔扇貝體內(nèi)開始適應(yīng)并觸發(fā)了對(duì)氟苯尼考的代謝，其代謝速率隨著體內(nèi)氟苯尼考的含量升高而提高且代謝速率升高具有滯后性，在蓄積開始階段短時(shí)間內(nèi)氟苯尼考的蓄積效應(yīng)大于代謝效應(yīng)，表現(xiàn)為蓄積第1天氟苯尼考含量的總體增加。而隨著體內(nèi)氟苯尼考含量的升高，代謝速率也不斷提高，使得代謝速率高于蓄積速率，氟苯尼考含量在2～3天內(nèi)開始下降。出現(xiàn)第二階段變化趨勢(shì)的原因可能為：櫛孔扇貝對(duì)氟苯尼考的代謝速率也隨著氟苯尼考含量的下降而逐漸降低，在低于其蓄積速率時(shí)又表現(xiàn)為氟苯尼考含量的升高，而且此時(shí)櫛孔扇貝出現(xiàn)部分中毒癥狀，代謝速率進(jìn)一步降低，因此出現(xiàn)蓄積后期4～8天氟苯尼考含量升高的情況。

而對(duì)于櫛孔扇貝不同組織的蓄積規(guī)律，在蓄積階段，將A組、B組和C組櫛孔扇貝各組織BCF值進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示在95%的置信水平下外套膜、內(nèi)臟團(tuán)和閉殼肌BCF值之間存在顯著性差異(P<0.01)，表明各組織對(duì)氟苯尼考的蓄積能力不同。內(nèi)臟團(tuán)中氟苯尼考含量明顯高于外套膜與閉殼肌，此后，櫛孔扇貝各組織中氟苯尼考含量順序一直為：內(nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼肌，這表明氟苯尼考的主要蓄積部位在內(nèi)臟團(tuán)，而閉殼肌的蓄積相對(duì)較小。這一結(jié)果與氨基脲等在櫛孔扇貝中的蓄積規(guī)律一致[23], 出現(xiàn)這樣情況的原因可能為內(nèi)臟團(tuán)作為櫛孔扇貝體內(nèi)的解毒組織，會(huì)對(duì)大部分的氟苯尼考進(jìn)行截留蓄積，但內(nèi)臟團(tuán)不能對(duì)較高濃度的氟苯尼考進(jìn)行全部截留，會(huì)有部分隨血液循環(huán)被其它部位蓄積。因此內(nèi)臟團(tuán)由于截留作用而使其蓄積能力最強(qiáng)，而閉殼肌也由于內(nèi)臟團(tuán)的的部分截留作用使其含量始終在3個(gè)組織中最小，因此食用閉殼肌比食用整體貝肉更安全。

2.4 櫛孔扇貝各組織對(duì)氟苯尼考的消除

A、B、C 3組櫛孔扇貝的外套膜、內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌對(duì)組織內(nèi)氟苯尼考清除情況分別如圖5、6、7所示，表4為消除階段櫛孔扇貝中各個(gè)組織、各濃度組的日均消除速率。

圖5 不同氟苯尼考濃度下櫛孔扇貝外套膜的消除曲線

圖6 不同氟苯尼考濃度下櫛孔扇貝內(nèi)臟團(tuán)的消除曲線

圖7 不同氟苯尼考濃度下櫛孔扇貝閉殼肌的消除曲線

日均消除速率①/10-4g·kg-1·d-1A組②B組③C組④外套膜⑤1.300.7800.254內(nèi)臟團(tuán)⑥1.230.9660.586閉殼?、?.2190.1250.037

Note：①Daily elimination rate；②Group A；③Group B；④Group C；⑤Mantle；⑥Visceral mass；⑦Adductor muscle

由圖5可知，消除過程中，在櫛孔扇貝外套膜中，A、B組氟苯尼考含量第1天開始較快下降，隨后，在第2～5天時(shí)氟苯尼考含量下降速度逐漸放緩，在第5天時(shí)含量維持在較低水平，接近為0。而C組櫛孔扇貝的外套膜中氟苯尼考含量在1～2天下降速度緩慢，從第3天開始下降速度加快，到第7天時(shí)，氟苯尼考含量接近為0。從表4可以看出，A組中外套膜對(duì)氟苯尼考日均消除速率最大，其次為B組，最后為C組。

從圖6可以看出，在清除過程中，A組扇貝內(nèi)臟團(tuán)中氟苯尼考含量下降，在第5天時(shí)含量接近為0；B組扇貝內(nèi)臟團(tuán)氟苯尼考含量在1～2天內(nèi)下降，從第3天下降速度開始減小，在第5天時(shí)氟苯尼考含量接近為0；C組內(nèi)臟團(tuán)中氟苯尼考含量在第1～3天期間平穩(wěn)下降，在第3天以后下降速度減小，在第7天時(shí)氟苯尼考含量接近為0。

據(jù)圖7可知，與外套膜、內(nèi)臟團(tuán)一樣，在消除階段，A、B、C組閉殼肌氟苯尼考含量緩慢下降，3組閉殼肌中氟苯尼考含量分別在第5、5、7天降至最低值，接近為0。

對(duì)消除過程中A、B和C組櫛孔扇貝同一組織中氟苯尼考含量分別進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示在95%的置信水平下各組均存在顯著性差異(P<0.01)，表明消除起始時(shí)體內(nèi)氟苯尼考含量對(duì)消除過程各組織中的消除速率有較大的影響。由表4可知，在消除階段櫛孔扇貝3個(gè)組織對(duì)氟苯尼考的日均消除速率大小順序?yàn)椋篈組>B組>C組。櫛孔扇貝各組織對(duì)氟苯尼考的日均消除速率大小順序?yàn)椋簝?nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼肌，原因可能是內(nèi)臟團(tuán)是櫛孔扇貝的解毒組織，對(duì)氟苯尼考的分解消除速率最快；而外套膜由于消除過程中和潔凈的海水直接接觸，物質(zhì)交換較快，因此消除的平均速率也相應(yīng)較快；閉殼肌中氟苯尼考含量本身較低，且與外界環(huán)境接觸較少，消除速率較慢。

閉殼肌作為櫛孔扇貝的主要食用部位，該部位在蓄積與消除過程中的氟苯尼考含量都是3個(gè)組織中最小的，在同一時(shí)間段時(shí)內(nèi)臟團(tuán)和外套膜中氟苯尼考含量大約是閉殼肌的2～7倍。因此櫛孔扇貝對(duì)氟苯尼考的蓄積主要集中在內(nèi)臟團(tuán)與外套膜中，但同時(shí)閉殼肌對(duì)氟苯尼考的消除能力是最小的，因此在氟苯尼考污染較為嚴(yán)重的海域內(nèi)，必須經(jīng)過一段時(shí)間的清除凈化才能出售采集的櫛孔扇貝。各國(guó)對(duì)水產(chǎn)品中氟苯尼考(胺)最大殘留限量的規(guī)定略有不同，中國(guó)規(guī)定魚類帶皮肉為1 mg·kg-1；歐洲規(guī)定為有鰭魚類帶皮肌肉1 mg·kg-1，每日允許攝入量(ADI)為3 μg·kg-1(體重)；加拿大規(guī)定鮭科魚類肌肉中0.8 mg·kg-1；美國(guó)食品藥物管理局規(guī)定的每日攝入量為10 μg·kg-1；對(duì)此要求最為嚴(yán)格的日本在《食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》中規(guī)定氟苯尼考在部分水產(chǎn)品MRL為0.1 mg·kg-1[12,24-25]。本文研究結(jié)果表明，在消除過程進(jìn)行1天后，閉殼肌中氟苯尼考含量最大不超過0.1 mg·kg-1，可以滿足上述各國(guó)家對(duì)氟苯尼考?xì)埩舻囊?，因此，?duì)櫛孔扇貝使用不超過200 mg·kg-1的氟苯尼考進(jìn)行藥浴后，在清水中清除24 h以上即可安全食用，選用的氟苯尼考濃度越高，停藥后所需要的清除時(shí)間越長(zhǎng)。

3 結(jié)論

(1)經(jīng)氟苯尼考櫛孔扇貝急性毒性實(shí)驗(yàn)可得，氟苯尼考對(duì)櫛孔扇貝的96 h半致死濃度LC50為213.1 mg/L，安全濃度為21.31 mg/L，符合魚藥分類等級(jí)中度毒性標(biāo)準(zhǔn)。

(2)蓄積過程中，櫛孔扇貝各組織(外套膜、內(nèi)臟團(tuán)、閉殼肌)對(duì)氟苯尼考蓄積濃度隨水體濃度增大而增大，而生物蓄積系數(shù)BCF隨著海水中氟苯尼考含量升高而下降；消除過程中，櫛孔扇貝各組織對(duì)氟苯尼考的日均消除速率大小順序?yàn)椋喊踩珴舛纫陨辖M>安全濃度水平組>安全濃度以下組。

(3)蓄積過程中，櫛孔扇貝各組織中氟苯尼考蓄積量大小順序?yàn)椋簝?nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼?。幌A段時(shí)，櫛孔扇貝各組織對(duì)氟苯尼考的日均消除速率大小順序?yàn)椋簝?nèi)臟團(tuán)>外套膜>閉殼肌。

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