甲基苯丙胺對脂多糖誘導(dǎo)小鼠血清和脾臟IL-1β、 IL-6和TGF-β表達(dá)的影響

賈雨薇，王 婧，王 彪，李國棟，陳 騰，陳艷炯

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部：1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系；2. 法醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710061)

甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)是一種高成癮性精神興奮藥物。METH濫用目前已成為困擾世界的一大社會問題，同時METH也是我國濫用最廣泛的毒品之一。METH可以破壞機(jī)體免疫防御系統(tǒng)，降低身體免疫力，增加人群感染率，并引起流行性疾病的傳播[1-3]。大量研究發(fā)現(xiàn)METH可以促進(jìn)HIV感染以及肝細(xì)胞內(nèi)丙肝病毒的復(fù)制[4-5]；METH還可以降低白細(xì)胞的增殖以及免疫球蛋白的產(chǎn)生[6-7]，影響巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的功能[8-11]。近年來，大量動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)METH從血液再分布到機(jī)體各組織的比率是不同的，METH在各個臟器中的累積率依次為腎臟>脾臟>大腦>肝臟>心臟>血清[12]，而脾臟是外周免疫應(yīng)答的主要場所。研究表明，METH可以使外周炎性細(xì)胞因子和趨化因子增加，這些改變與METH濫用引起的免疫功能障礙、神經(jīng)元損傷和持續(xù)性認(rèn)知障礙有關(guān)[13]。因此，揭示METH暴露是如何作用于人體外周免疫系統(tǒng)尤其是脾臟以及其作用機(jī)制可以對METH誘導(dǎo)的免疫損傷提供新的治療思路。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)即內(nèi)毒素，作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁成分，能夠通過結(jié)合CD4/TLR4/MD2受體復(fù)合物促進(jìn)巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，從而引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。在研究METH對免疫系統(tǒng)的影響中，LPS常被用做免疫刺激劑[14-16]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)METH作用能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)為大劑量METH急性處理小鼠后短時間內(nèi)可顯著增加LPS誘導(dǎo)的脾臟IL-6和IL-10的表達(dá)，但對TNF-α表達(dá)無影響[17]；此外，METH還可以抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腸道黏膜肥大細(xì)胞活化，同時抑制小鼠肺臟、胸腺和BMMCs中肥大細(xì)胞源性細(xì)胞因子的表達(dá)[18]?；谝陨瞎ぷ骰A(chǔ)，本研究進(jìn)一步探究逐漸遞增劑量METH暴露對外周免疫系統(tǒng)的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)利用C57BL/6小鼠，建立模擬人類藥物成癮的模型，觀察慢性逐漸遞增劑量METH處理后LPS誘導(dǎo)的小鼠血清及脾臟中IL-1β、IL-6和TGF-β的表達(dá)變化情況，為揭示METH作用對免疫系統(tǒng)的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠(北京維通利華)，雄性，體質(zhì)量(16±2)g，32只，隨機(jī)分籠，每籠4只，室溫(22±3)℃，12～12 h晝夜循環(huán)，非直接光照條件下生活，自由進(jìn)食進(jìn)水。動物飼養(yǎng)及動物實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照西安交通大學(xué)動物管理機(jī)構(gòu)委員會準(zhǔn)則施行。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑配制 METH粉劑(中國生物制品檢定所)，溶于生理鹽水，完全溶解后用濾菌器(過濾孔徑0.22 μm)過濾。LPS(大腸桿菌血清型O26:B6，Sigma)溶于生理鹽水，完全溶解后用濾菌器(過濾孔徑0.22 μm)過濾。蛋白酶抑制劑片劑和磷酸化酶抑制劑片劑各1片使用前溶解于10 mL RIPA組織細(xì)胞快速裂解液(陜西先鋒生物科技有限公司)中。IL-1β、IL-6和TGF-β ELISA試劑盒(美國Ebioscience公司)。

1.3 用藥方案 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組，即：生理鹽水+生理鹽水組(S+S)、生理鹽水+脂多糖組(S+L)、METH+生理鹽水組(M+S)、METH+脂多糖組(M+L)。模擬人類藥物成癮暴露方式，分段式漸進(jìn)性遞增劑量隔天給予小鼠i.p. METH(第1周0.5 mg/kg、第2周1.0 mg/kg、第3周2.0 mg/kg、第4周4.0 mg/kg)或生理鹽水(10.0 mL/kg)[19]，在最后一劑METH之后24 h給小鼠i.p. LPS(0.33 mg/kg)或生理鹽水(10.0 mL/kg)[20]。LPS后2 h眼球采血，采集的血液標(biāo)本4 ℃冰箱過夜，待其完全凝固后，在2 000 r/min條件下離心30 min并收獲血清；并收集小鼠脾臟凍存于-80 ℃冰箱，待處理。

1.4 脾臟組織裂解處理 將待處理的小鼠脾臟從-80 ℃冰箱取出，向每個脾臟中加入事先配好的RIPA裂解液600 μL，將脾臟組織完全淹沒。利用超聲細(xì)胞裂解儀將組織打碎(4 min，40 Hz)，使組織呈勻漿狀態(tài)。將勻漿在冰上靜置1 h左右，以進(jìn)一步裂解。之后利用低溫高速離心機(jī)，在4 ℃ 2 000 r/min條件下離心15 min。待離心結(jié)束后，迅速將上清液轉(zhuǎn)移到無菌無酶的EP管中，放入-80 ℃冰箱，用于脾臟細(xì)胞因子檢測。

1.5 細(xì)胞因子檢測 取出凍存于-80 ℃冰箱的血清和脾臟勻漿樣本于室溫緩慢復(fù)融后，參照ELISA試劑盒說明書，檢測IL-1β、IL-6和TGF-β的表達(dá)變化。

2 結(jié) 果

2.1 METH對LPS誘導(dǎo)小鼠血清IL-1β、IL-6和TGF-β表達(dá)的影響 與S+S對照組相比，METH單獨(dú)作用(M+S)時對血清中IL-6的表達(dá)沒有影響，但使TGF-β的表達(dá)水平顯著下降(F=46.235；P<0.001)；當(dāng)給予了LPS后，與S+L對照組相比，METH作用(M+L)顯著升高了小鼠血清中IL-6的含量(F=61.963；P<0.001)，然而對TGF-β的表達(dá)水平?jīng)]有影響(圖1)。由于血清中IL-1β的表達(dá)量過低，結(jié)果未展示。

圖1 METH對LPS誘導(dǎo)小鼠血清IL-6和TGF-β表達(dá)的影響

Fig.1 Effects of METH injection on LPS-induced IL-6 and TGF-β expressions in the serum of mice

A：M+L組與S+L組相比，###P<0.001；B：M+S組與S+S組相比，***P<0.001；各組小鼠n=8。

2.2 METH對LPS誘導(dǎo)小鼠脾臟IL-1β、IL-6和TGF-β表達(dá)的影響 與S+S對照組相比，METH單獨(dú)作用(M+S)時對脾臟中IL-1β、IL-6和TGF-β細(xì)胞因子的表達(dá)沒有影響；然而，在LPS的作用下，與S+L對照組相比，METH作用(M+L)顯著升高了IL-6的含量(F=46.851；P<0.001)，降低了小鼠脾臟中的TGF-β的含量(F=20.751；P<0.001)，卻對IL-1β的表達(dá)沒有影響(圖2)。

圖2 METH對LPS誘導(dǎo)小鼠脾臟IL-1β、IL-6和TGF-β表達(dá)的影響

Fig.2 Effects of METH injection on LPS-induced IL-1β, IL-6 and TGF-β expressions in the spleen of mice

A：各組間比較無顯著性差異；B：M+L組與S+L組相比，###P<0.001；C：M+L組與S+L組相比，###P<0.001；各組小鼠n=8。

3 討 論

以往研究表明，METH在循環(huán)水平調(diào)控細(xì)胞因子的機(jī)制較為復(fù)雜[13,15,21]，它是由多器官系統(tǒng)共同作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，METH單獨(dú)作用時對血清中IL-6的表達(dá)沒有影響，但卻使TGF-β的含量顯著下降(P<0.001)。TGF-β是一種多功能性生長因子，它主要在炎癥調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、腫瘤侵襲和神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮作用，并且參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、分化和免疫反應(yīng)[22-23]。因此在METH作用后，血清中TGF-β的含量下降，表明長期METH暴露可能損害組織損傷的修復(fù)，給機(jī)體造成了負(fù)面影響。給予LPS刺激后，METH使小鼠血清中IL-6細(xì)胞因子的表達(dá)水平較單獨(dú)METH暴露后顯著升高(P<0.001)，卻對TGF-β的表達(dá)沒有影響，表明METH對LPS誘導(dǎo)小鼠血清IL-6產(chǎn)生有明顯的促進(jìn)作用。IL-6作為前炎性細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)過程中起著重要的作用，它能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能。有研究表明，在炎癥、感染和患有某些腫瘤等情況下，血清中IL-6的含量會有不同程度上升[24]。因此，METH可能增強(qiáng)了LPS誘導(dǎo)對小鼠免疫系統(tǒng)的影響，且與IL-6相關(guān)。

脾臟是人體最大的外周免疫器官，也是對血源性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場所。METH作用同時也會影響脾臟中免疫相關(guān)細(xì)胞與細(xì)胞因子的表達(dá)改變，進(jìn)一步引起炎性反應(yīng)與組織損傷。SAITO等[25]研究發(fā)現(xiàn)，METH可以使脾臟的淋巴細(xì)胞，如白細(xì)胞和NK細(xì)胞活性減低。PEERZADA[26]的研究發(fā)現(xiàn)，慢性遞增劑量METH處理后，脾臟中前炎性細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-12的增多與持續(xù)的細(xì)胞炎性應(yīng)答和組織損傷有關(guān)。本研究對脾臟IL-1β、IL-6和TGF-β的檢測發(fā)現(xiàn)，METH單獨(dú)作用時，對其細(xì)胞因子的影響沒有顯著性改變。然而在METH作用后再給予LPS時，IL-6的表達(dá)水平大幅度升高(P<0.001)；同時，TGF-β的表達(dá)水平也明顯下降(P<0.001)；而無論有無LPS的刺激，METH對脾臟中IL-1β的表達(dá)沒有影響。以上結(jié)果表明，當(dāng)機(jī)體沒有發(fā)生炎性反應(yīng)時，METH對脾臟的細(xì)胞因子沒有明顯的影響；一旦由于某種因素刺激機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)后，長期的METH作用會加劇這種炎性反應(yīng)，給機(jī)體造成進(jìn)一步的損傷。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，METH作用于機(jī)體產(chǎn)生炎性反應(yīng)的機(jī)制與中樞神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)[14-15]。METH增強(qiáng)了中樞炎性反應(yīng)，伴隨著外周炎性細(xì)胞因子的增加；與此同時，外周的免疫刺激能夠激活大腦的膠質(zhì)細(xì)胞，其釋放的細(xì)胞因子和趨化因子在METH誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷中起主要作用。LIU等[27]還發(fā)現(xiàn)，METH和LPS在某種程度上可以協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，而NF-κB和MAPK信號通路在METH和LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子中發(fā)揮主要作用。這些研究進(jìn)一步支持了METH能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的觀點(diǎn)，提示METH作用和LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生過程有共通的分子機(jī)制。

綜上所述，長期METH作用既可以增加炎性細(xì)胞因子的含量，也可以降低抗炎因子的含量，從而影響機(jī)體的免疫反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)對我們以后進(jìn)一步研究METH濫用對機(jī)體免疫反應(yīng)影響的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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