基于基因組學(xué)探討糖尿病腎病的發(fā)病原因 及其與心血管疾病的關(guān)系

任曉梅，楊景鋒，劉啟玲，辛 寶，張榮強(qiáng)

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西咸陽(yáng) 712046)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，糖尿病患者數(shù)量在全球范圍內(nèi)快速增長(zhǎng)。2013年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)20～79歲糖尿病患者為0.98億，預(yù)計(jì)到2035年將增至1.43億[1]。糖尿病對(duì)人體的危害主要體現(xiàn)在其引發(fā)的多種并發(fā)癥上，如糖尿病眼病、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病腎病(diabetes kidney disease, DKD)等，而DKD是導(dǎo)致終末期腎病發(fā)生的主要原因[2]。之前單個(gè)的基因研究尚未闡釋DKD的發(fā)病原因，需要更進(jìn)一步的探索。本研究對(duì)基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Expression Omnibus, GEO)收錄的一組DKD患者腎小球組織差異表達(dá)的基因芯片數(shù)據(jù)資料進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探討DKD患者腎臟分子網(wǎng)絡(luò)改變情況及其可能涉及的分子生物學(xué)功能，為DKD的早期診斷及治療提供臨床依據(jù)，對(duì)患者預(yù)后的影響具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 差異表達(dá)的基因數(shù)據(jù) 本研究所采用的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)是從Pubmed下載所得，在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中以“diabetic kidney disease”為檢索詞進(jìn)行檢索，獲得PARK AS, MOHTAT D等提交的芯片數(shù)據(jù)GSE30528，此數(shù)據(jù)集于2011年7月提交并于2017年1月更新。GSE30528所用實(shí)驗(yàn)平臺(tái)為Affymetrix公司提供的人類Human Genome U133A 2.0基因表達(dá)芯片平臺(tái)GPL571?？偣?2個(gè)樣本，其中DKD患者腎小球RNA標(biāo)本9例，健康對(duì)照組13例。GSE30528數(shù)據(jù)集共包含了22 277個(gè)基因的表達(dá)資料，本研究重點(diǎn)分析其生物信息學(xué)特征。

1.2 兩組人群基因表達(dá)譜系分析 Qlucore Omics Explorer(QOE)可用于基因芯片、蛋白芯片等的分析，功能完善，操作簡(jiǎn)便。本研究利用QOE 3.1和R語(yǔ)言對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先對(duì)數(shù)據(jù)集GSE30528中的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行(均數(shù)=0，標(biāo)準(zhǔn)差=1)標(biāo)準(zhǔn)化處理；通過(guò)(P<0.01，q<0.01)過(guò)濾后行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，篩選出DKD患者與健康對(duì)照組的差異表達(dá)基因，然后對(duì)數(shù)據(jù)集GSE30528中的基因芯片數(shù)據(jù)行主成分分析及分層聚類分析。

1.3 差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用圖譜分析 將DKD患者與健康對(duì)照組差異表達(dá)的前20個(gè)基因相應(yīng)的蛋白名稱上傳至蛋白-蛋白相互作用在線分析軟件STRING 10.0，根據(jù)具體的分析結(jié)果適當(dāng)調(diào)節(jié)可信度和附加節(jié)點(diǎn)參數(shù)，繪制兩組差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用圖譜。

1.4 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析 將篩選出的前20個(gè)差異表達(dá)基因上傳至GenCliP 2.0，選擇GO功能富集狀況分析，根據(jù)需要調(diào)節(jié)各類分析的主要參數(shù)后進(jìn)行分析。

1.5 差異表達(dá)基因及信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 將兩組Top 250差異基因?qū)隚CBI，分析并繪制差異表達(dá)基因及信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，以探尋在DKD發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理 數(shù)據(jù)集GSE30528 DKD患者及健康對(duì)照組腎小球組織中基因表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化之后，各樣本的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)均以0為中心波動(dòng)，提示數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性好，可以進(jìn)一步展開分析。

2.2 兩組人群基因表達(dá)模式的比較 根據(jù)人群基因表達(dá)主成分分析結(jié)果，兩組人群的基因表達(dá)模式可見明顯差異，X軸、Y軸、Z軸的數(shù)據(jù)方差貢獻(xiàn)率分別為9%、6%、50%，在Z軸方向上DKD患者與健康對(duì)照組表達(dá)差異最明顯，提示DKD會(huì)影響患者腎小球組織的基因表達(dá)模式。

2.3 DKD患者與健康對(duì)照組腎小球差異表達(dá)基因分析 DKD患者與健康對(duì)照組腎小球組織中共有844個(gè)差異表達(dá)基因(P<0.05，q<0.05, Fold change≥2)，其中DKD下調(diào)的有606個(gè)(71.80%)，上調(diào)的有238個(gè)(28.20%)，兩組基因轉(zhuǎn)錄譜火山圖見圖1。兩組人群腎小球組織差異表達(dá)前20位基因列表見表1。

圖1 DKD患者與健康對(duì)照組腎小球組織表達(dá)譜的比較

Fig.1 Gene expression profile in the glomerulus of DKD patients and controls

2.4 差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用結(jié)果 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中包含1個(gè)最典型的子網(wǎng)絡(luò)(圖2)，主要與肌節(jié)收縮蛋白的合成等生物學(xué)功能有關(guān)。其中，TNNT2與網(wǎng)絡(luò)中的其他≥7個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系，刪除該節(jié)點(diǎn)后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散，可以認(rèn)為TNNT2是子網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)，提示TNNT2對(duì)于DKD的診斷具有一定的價(jià)值。

2.5 TNNT2基因功能及其相關(guān)疾病譜分析 采用GCBI基因雷達(dá)對(duì)TNNT2基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證。TNNT2可直接與TPM1、TPM2、TPM3、TPM4等蛋白相結(jié)合(圖3A)，TPM1、TPM2、TPM3、TPM4在心臟收縮等過(guò)程中起關(guān)鍵作用。在發(fā)表的與TNNT2有關(guān)的文獻(xiàn)里，TOP 20的疾病中，有至少11種與心血管疾病有關(guān)(圖3B)，提示：對(duì)心血管疾病具有關(guān)鍵調(diào)控作用的TNNT2基因在DKD發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中也起著重要作用。

表1 兩組人群腎小球組織差異表達(dá)前20位基因

Tab.1 Top 20 differentially expressed genes in DKD patients and controls

序號(hào)上調(diào)(縮寫)基因名稱序號(hào)下調(diào)(縮寫)基因名稱1C1QB補(bǔ)體C1qβ鏈多肽11PRKAR2B蛋白激酶cAMP依賴型Ⅱ型調(diào)節(jié)亞基β2C1QA補(bǔ)體C1qα鏈多肽12NPHS1腎升壓素3SERPINE2絲氨酸蛋白酶抑制劑(分支E,2號(hào)成員)13LOX賴氨酰氧化酶4RNASE6核糖核酸酶家族成員k614MAGI2膜相關(guān)鳥苷酸激酶轉(zhuǎn)化蛋白25ACTN1肌動(dòng)蛋白α115NEBL肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Z盤狀蛋白6OLFML3嗅覺(jué)素樣蛋白316LRRC2亮氨酸豐富重復(fù)含27TMPRSS4跨膜蛋白酶,絲氨酸417LPL脂蛋白脂肪酶8ADRA2A腎上腺素受體α2A18TNNT2心肌肌鈣蛋白T29GGT5γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶519PLCE1磷脂酶Cε110ITGB7整合素亞基β720CHI3L1幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1

圖2 差異表達(dá)基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

Fig.2 Network of protein-protein interactions for differentially expressed genes

2.6 差異表達(dá)基因功能分析 GO功能富集分析結(jié)果顯示，12個(gè)(60%)基因(LOX、OLFML3、NEBL、ITGB7、NPHS1、LPL、PRKAR2B、CHI3L1、SERPINE2、C1QB、C1QA、RNASE6)與胞外囊泡、細(xì)胞器的形成有關(guān)；3個(gè)(15%)基因(LPL、PRKAR2B、SERPINE2)與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；2個(gè)(10%)基因(MAGI2、RNASE6)與腎小球內(nèi)臟上皮細(xì)胞發(fā)育、過(guò)濾膜形成、狹縫隔膜形成有關(guān)。

2.7 DKD患者與健康對(duì)照組差異表達(dá)基因信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) DKD患者與健康對(duì)照組差異表達(dá)基因共涉及48條信號(hào)通路，其中下調(diào)的有2條(4.17%)，上調(diào)的有4條(8.33%)，既有上調(diào)又有下調(diào)的42條(87.50%)。48條信號(hào)通路中，共有176個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)，其中涉及網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)最多的信號(hào)通路為MAPK信號(hào)通路，共涉及30個(gè)節(jié)點(diǎn)，共有28條信號(hào)通路與其存在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，該信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)主要與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等作用有關(guān)(圖4)。

圖3 TNNT2基因雷達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(A)及其相關(guān)疾病譜(B)

Fig.3 Regulation networks revealed by GCBI gene radar (A) and related diseases (B) of TNNT2

圖4 DKD患者與健康對(duì)照組腎小球差異表達(dá)基因涉及信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(藍(lán)色為上調(diào)，黃色為既有下調(diào)又有上調(diào))

Fig.4 The co-expression network of pathways of differentially expressed genes in the glomerulus of DKD patients and controls

2.8 DKD患者與健康對(duì)照組差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò) 在兩組研究對(duì)象844個(gè)差異表達(dá)基因中，共有139個(gè)基因存在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，其中90個(gè)(64.75%)為下調(diào)基因，49個(gè)(35.25%)為上調(diào)基因。病例組下調(diào)最明顯的6個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)镻LCG2、RASGRP3、JAM3、ERBB4、SH3GLB1、KDR，其共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)見圖5；病例組上調(diào)最明顯的5個(gè)差異表達(dá)基因?yàn)镻DGFRA、CD44、ITGB2、ACTN1、RAC2，其共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)見圖6。

圖5 DKD患者與健康對(duì)照組腎小球TOP 6下調(diào)差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(紅色為下調(diào)，藍(lán)色為上調(diào))

Fig.5 The co-expression network of top 6 down-regulated genes in the glomerulus of DKD patients and controls

圖6 DKD患者與健康對(duì)照組腎小球TOP 5上調(diào)差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(紅色為下調(diào)，藍(lán)色為上調(diào))

Fig.6 The co-expression network of top 5 up-regulated genes in the glomerulus of DKD patients and controls

3 討 論

DKD是指由糖尿病引起的一種嚴(yán)重的腎臟微血管病變，是糖尿病致死的主要原因，其發(fā)病率隨著糖尿病發(fā)病率的升高亦呈現(xiàn)出明顯升高趨勢(shì)[3]。DKD在臨床上最初表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)率的減少，進(jìn)而出現(xiàn)蛋白尿、動(dòng)脈血壓升高和體液潴留，最終導(dǎo)致腎臟衰竭。

本研究利用基因組學(xué)分析技術(shù)對(duì)DKD患者腎小球組織基因芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了細(xì)致挖掘和分析?；虮磉_(dá)譜提示，與正常人群相比，DKD患者腎小球組織基因表達(dá)出現(xiàn)明顯改變，共發(fā)現(xiàn)844個(gè)差異表達(dá)基因。兩組前20個(gè)差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)包含1個(gè)典型的子網(wǎng)絡(luò)，該子網(wǎng)絡(luò)以TNNT2基因?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)核心。TNNT2基因是肌鈣蛋白家族心肌亞型的一種，是調(diào)節(jié)心臟肌肉收縮的肌鈣蛋白復(fù)合體組成之一，在心肌細(xì)胞收縮和舒張過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。以往研究表明，CRP、IL-1、IL-6、IL-18等多種炎癥因子和途徑都在DKD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，在DKD患者中表達(dá)水平明顯升高[5-7]；同時(shí)，在心肌梗死等心血管疾病患者中，CRP水平也明顯升高[8]，提示炎癥反應(yīng)是DKD和心血管疾病的共同危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果表明，在DKD患者中，TNNT2基因表達(dá)明顯降低，表明DKD患者的心肌細(xì)胞收縮和舒張功能有下降趨勢(shì)。DKD是終末期腎病發(fā)生的主要原因，而終末期腎病患者死亡的主要原因是心血管疾病，其比例能占到50%以上[9]。上述分析綜合提示，DKD患者通常伴有心臟功能的減弱，TNNT2基因在上述病變過(guò)程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

GO功能富集分析顯示，LPL、PRKAR2B、SERPINE2與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。既往研究證實(shí)，氧化應(yīng)激在DKD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到關(guān)鍵性的作用，患者機(jī)體在高血糖狀態(tài)下通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)，在腎臟組織中過(guò)量生成氧自由基，刺激單核細(xì)胞趨化蛋白-1高表達(dá)，最終導(dǎo)致腎臟損傷，甚至引起終末期腎衰[10-11]。張志全等[12]的研究結(jié)果表明，白藜蘆醇可以通過(guò)有效改善患者超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等氧化應(yīng)激指標(biāo)，起到腎臟修復(fù)作用。

差異表達(dá)基因信號(hào)通路共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)一個(gè)涉及網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)最多的信號(hào)通路——MAPK信號(hào)通路，此信號(hào)通路在基因表達(dá)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究結(jié)果表明，MAPK在DKD患者的腎臟組織中活性明顯增強(qiáng)[13-14]，這與我們的研究結(jié)果完全吻合。

基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)在病例組篩選出6個(gè)明顯下調(diào)和5個(gè)明顯上調(diào)的差異表達(dá)基因。有研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)基因中的RASGRP3，一種鳥核苷酸交換蛋白，能夠有效活化Rap1分子，繼而通過(guò)ERK信號(hào)通路，抑制炎癥因子IL-6的產(chǎn)生[15]。這種負(fù)向調(diào)節(jié)IL-6的功能有助于緩解炎癥的發(fā)生發(fā)展，對(duì)臨床預(yù)防和治療DKD和心血管疾病提供重要參考。

本研究從基因組學(xué)的角度，分析了DKD的發(fā)生原因及其與心血管疾病發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果提示，在高血糖等刺激因素作用下，炎癥相關(guān)信號(hào)通路MAPK等被激活，造成體內(nèi)氧化應(yīng)激水平提高和炎癥因子的分泌增加。這些因素在導(dǎo)致腎組織損傷的同時(shí)，同時(shí)引起多種大血管和微血管病變。提示在糖尿病發(fā)生的過(guò)程中積極控制血糖、控制炎癥，可以對(duì)DKD和心血管疾病的治療同時(shí)起到積極作用。

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