腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與新疆哈薩克族 食管鱗癌的相關(guān)性分析

劉 凱，劉記紅，江現(xiàn)麗，王雪麗，袁 野，袁偉媛， 王利霞，梁偉華，李 鋒, 2，胡建明

(1. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系/石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，新疆石河子 832002； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)朝陽醫(yī)院病理科，北京 100020)

食管癌是我國最常見的惡性消化道腫瘤之一。位于我國西北部的新疆哈薩克族(哈族)是食管癌的高發(fā)民族，由于特殊的地域、民族和經(jīng)濟(jì)落后等因素，其食管癌的死亡率高達(dá)68.95/10萬，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于全國均水平的14.95/10萬[1]。食管癌的發(fā)病癥狀隱匿，病情進(jìn)展快，預(yù)后較差，5年生存率僅有10%～25%，其主要原因與高侵襲性有關(guān)[2]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起到重要的作用[3-4]。巨噬細(xì)胞可分為M1和M2兩種亞型，兩者在免疫功能上存在顯著差異[5]。M1型巨噬細(xì)胞可釋放大量的炎性因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)等，具有殺滅微生物、破壞癌細(xì)胞的活性。M2型巨噬細(xì)胞低表達(dá)IL-12和MHC-Ⅱ類分子，高表達(dá)IL-10[6]，因具有與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)類似的表型，在抑制炎癥、促進(jìn)腫瘤生長和免疫抑制中發(fā)揮重要的作用[7]。盡管腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在多種腫瘤的研究中已經(jīng)顯示其促癌的作用，但其在哈族食管鱗癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚未探明，故我們擬通過檢測腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在食管鱗癌中的分布，結(jié)合臨床病理學(xué)特征及預(yù)后，初步探討腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在新疆哈族食管鱗癌發(fā)生和進(jìn)展中的作用及其與食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 組織來源及處理 收集2008年5月至2014年6月份伊犁州友誼醫(yī)院病理科具有完整臨床病理資料的哈族食管癌患者癌及癌旁正常組織石蠟樣本各100例(組織相關(guān)病理參數(shù)信息詳見表1)?；颊吣行?0名，女性30名。年齡分布為35～76歲，平均年齡58歲。術(shù)后病理診斷證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌。所有患者術(shù)前均未接受放、化療等相關(guān)治療。記錄患者的臨床病理參數(shù)，根據(jù)WHO Classification Tumours of the Digestive System[8]，食管鱗癌的組織學(xué)分級：高分化鱗癌29例，中分化鱗癌48例，低分化鱗癌23例；癌組織浸潤深度：浸潤黏膜-肌層(T1～T2)36例，浸潤外膜及食管周圍結(jié)構(gòu)(T3～T4)64例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期62例，Ⅲ～Ⅳ期38例。患者臨床手術(shù)治療后行預(yù)后隨訪，隨訪時間2～6年，隨訪方式為電話及信件隨訪。所有病例癌及癌旁組織制成石蠟標(biāo)本，行HE染色，由2名高年資病理科診斷醫(yī)生進(jìn)行復(fù)診，并對免疫組化切片進(jìn)行診斷分析。

1.2 抗體及試劑 小鼠抗人CD68單克隆抗體(北京中杉金橋公司，克隆號：KP1)；免疫組化：Envision二步法試劑盒(武漢博士德公司，SV0001、SV0002)；DAB顯色試劑盒(Dako公司，貨號：K5001)。

1.3 免疫組化染色 將組織標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟水化后將組織切片置于枸櫞酸微波加熱8 min，后將切片放于H2O2溶液中靜置10 min，用PBS緩沖液輕微振洗3次后，配置一抗4 ℃過夜。于第二日將組織切片放置溫箱37 ℃孵育半小時，PBS緩沖液輕微振洗3次后滴加二抗，放入溫箱37 ℃孵育30 min后加DAB進(jìn)行顯色，顯色后用水沖洗，蘇木素復(fù)染核3 min，用酸乙醇分化4～6 s，后放入自來水中藍(lán)化5 min，后用乙醇梯度脫水，后用中性樹膠封片。以扁桃體組織作為CD68分子的陽性對照，PBS緩沖溶液代替一抗作為陰性對照。

1.4 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的計數(shù) CD68分子表達(dá)位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，同時CD68可特異性標(biāo)記腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。計數(shù)方法[9-10]為每例組織切片在顯微鏡下通過低倍鏡(×100)觀察，選取5個具有代表性的區(qū)域，即“熱區(qū)”，同時由2位不同的臨床病理醫(yī)生在高倍鏡(×400)下確定癌巢及間質(zhì)部位中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的數(shù)目，具體數(shù)目判讀方法為每張組織切片(癌巢和癌間質(zhì)部位)在顯微鏡下選取5個“熱區(qū)”視野，計數(shù)陽性細(xì)胞的數(shù)量，然后取其平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 本研究應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)分析癌及癌旁正常組織中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布差異。采用四格表χ2檢驗(yàn)分析腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，最后應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析法分析CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的密度與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在哈族食管鱗癌患者癌及癌旁正常組織中的分布 本實(shí)驗(yàn)中采用CD68分子作為癌及癌旁正常組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物。CD68陽性表達(dá)部位在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。我們發(fā)現(xiàn)CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要位于癌組織間質(zhì)中，少數(shù)位于癌巢中(圖1)。同時與癌旁正常組織上皮及間質(zhì)部位相比，哈族食管鱗癌組織中癌巢和間質(zhì)部位的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯增多(P<0.001，圖2)。

圖1 哈族食管鱗癌患者癌及癌旁正常組織CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布情況Fig.1 Distribution of CD68-positive TAMs in Kazakh esophageal squamous cell carcinoma and cancer adjacent normal tissues

A：癌旁正常組織上皮部位CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布；B：癌旁正常組織間質(zhì)部位CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布；C：食管鱗癌組織癌巢部位CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布；D：食管鱗癌組織間質(zhì)部位CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布。

圖2 哈族食管鱗癌患者癌和癌旁組織中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的差異性分布

Fig.2 The different distribution of CD68-positive TAMs in Kazakh esophageal squamous cell carcinoma and cancer adjacent normal tissues

A：食管鱗癌癌巢中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯多于癌旁正常組織上皮(P<0.001)；B：食管鱗癌間質(zhì)中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯多于癌旁正常組織間質(zhì)部位(P<0.001)。

2.2 哈族食管鱗癌患者CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布與其臨床病理特征的關(guān)系 我們分析了CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與哈族食管鱗癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)癌巢部位中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的數(shù)量與食管鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期(晚期)具有顯著的相關(guān)性(P<0.05)；而這種相關(guān)性更明顯的體現(xiàn)在間質(zhì)中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期(晚期)之間(P<0.001，表1)。

2.3 CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與哈族食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系 為進(jìn)一步研究高密度CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是否會對哈族食管鱗患者的臨床預(yù)后產(chǎn)生不良影響，我們采用Kaplan-Meier生存曲線分析食管鱗癌組織中不同部位CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞密度與哈族食管鱗癌中預(yù)后的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞密度在瘤間質(zhì)部位中的高低分布與哈族食管鱗癌不良預(yù)后無顯著的相關(guān)性(P>0.05，圖3)。然而在腫瘤癌巢部位可發(fā)現(xiàn)CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞密度的高低分布與哈族食管鱗癌不良預(yù)后有顯著的相關(guān)性(P<0.001，圖3)。

3 討 論

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是一種高度異質(zhì)性的細(xì)胞群體，在體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境中表現(xiàn)出獨(dú)特的表型和功能[11]。研究證實(shí)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加與多種腫瘤的進(jìn)展及不良的預(yù)后存在明顯的相關(guān)性[12-15]。然而，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在哈族食管鱗癌發(fā)生、進(jìn)展及其與患者預(yù)后的相關(guān)性尚未闡明清楚。

研究證實(shí)CD68可作為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的特異標(biāo)志物，在食管鱗癌組織中，我們發(fā)現(xiàn)CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞主要位于腫瘤間質(zhì)中，癌巢中也有少許CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞存在。通過分析我們發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中癌巢和間質(zhì)部位的CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)目較癌旁正常組織明顯增多，結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)癌組織癌巢和間質(zhì)中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的數(shù)量與哈族食管鱗癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期具有顯著的正相關(guān)性。學(xué)者XIE等[16]在其食管鱗癌的研究報道中也得到相似的結(jié)果，在癌間質(zhì)中，我們還發(fā)現(xiàn)CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的數(shù)量與腫瘤部位也具有相關(guān)性，即食管中段腫瘤中CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯多于食管下段，相似的結(jié)果在甲狀腺乳頭狀癌和黑色素瘤中也可見到[17-18]。上述結(jié)果提示CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，尤其是位于癌間質(zhì)部位中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與哈族食管鱗癌的發(fā)生及發(fā)展具有緊密的相關(guān)性。

表1 哈族食管鱗癌患者CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布與其臨床病理特征的關(guān)系

Tab.1 Correlation between the distribution of CD68-positive TAMs and the clinical pathology of Kazakh esophageal squamous cell carcinoma

病理參數(shù)病例數(shù)癌巢(x±s)P癌間質(zhì)(x±s)P年齡(歲) ≤58538.91±7.19 >58478.83±5.990.95544.32±30.8743.09±23.00 0.823性別 男709.14±7.33 女308.23±4.580.53243.51±28.4144.27±25.07 0.900腫瘤部位 上段212.00±9.89 中段7414.20±13.30 下段2415.82±10.450.06242.50±10.6148.16±28.3530.21±20.09 0.018*分化程度 高分化299.00±6.01 中分化489.50±7.58 低分化237.39±5.040.79445.14±29.5446.92±25.6635.35±27.30 0.237浸潤深度 T1～T2367.19±5.25 T3～T4649.81±7.140.05740.11±27.2245.78±27.39 0.322淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 無轉(zhuǎn)移507.18±5.09 有轉(zhuǎn)移5010.56±7.530.010*33.32±21.0554.16±29.05<0.001*臨床分期 Ⅰ～Ⅱ期627.19±5.20 Ⅲ～Ⅳ期3811.61±7.770.001*34.97±22.2958.05±28.98<0.001*

*P<0.05。

圖3 CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分布與哈族食管鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性

Fig.3 Correlation between the distribution of CD68-positive TAM and the prognosis of Kazakh patients with esophageal squamous cells

A：CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞密度在癌巢部位中與哈族食管鱗癌不良預(yù)后有顯著的相關(guān)性；B：CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞密度在間質(zhì)部位中與哈族食管鱗癌預(yù)后無顯著的相關(guān)性。

研究結(jié)果顯示，CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加與哈族食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，那么這種相關(guān)性是否還預(yù)示著患者的不良預(yù)后呢？為此我們進(jìn)一步結(jié)合食管鱗癌患者的預(yù)后情況，分析發(fā)現(xiàn)食管鱗癌癌巢部位中高密度CD68陽性的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與哈族食管鱗癌患者較差的預(yù)后關(guān)系密切，相似的結(jié)果也出現(xiàn)在舌咽鱗癌和甲狀腺乳頭狀癌的研究報道中[19-20]。提示腫瘤組織癌巢中浸潤的CD68陽性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量的不斷增加促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，可能可以作為哈族食管鱗癌不良預(yù)后的評判指標(biāo)。食管鱗癌間質(zhì)中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞密度的增高雖也顯示患者不良預(yù)后，但無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)合臨床病理參數(shù)分析我們發(fā)現(xiàn)食管鱗癌間質(zhì)較癌巢腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞數(shù)量的增多，顯示與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期關(guān)系更密切，但預(yù)后反而癌巢巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加與患者預(yù)后關(guān)系更密切。提示癌巢與間質(zhì)中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可能對腫瘤細(xì)胞具有不同程度的免疫作用，其對放化療產(chǎn)生的敏感性及抵抗作用也不相同，可能是導(dǎo)致不同部位腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對食管鱗癌臨床病理特征與預(yù)后影響不完全一致的原因。

[1] 王秀梅，李鋒，秦江梅，等. 新疆哈薩克族食管癌危險因素病例對照研究[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2007, 23(6):737-738.

[2] EKMAN S, DREILICH M, LENNARTSSON J, et al. Esophageal caner: Current and emerging therapy modalities[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2008, 8(9):1433-1448.

[3] JOYCE JA, POLLARD JW. Microenvironmental regulation of metastasis[J]. Nat Rev Cancer, 2009, 9(4):239-252.

[4] STEINER JL, DAVIS JM, MCCLELLAN JL, et al. Effects of the MCP-1 synthesis inhibitor bindarit on tumorigenesis and inflammatory markers in the C3(l)/SV40Tag mouse model of breast cancer[J]. Cytokine, 2014, 66(1):60-68.

[5] BISWAS SK, MANTOVANI A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm[J]. Nat Immunol, 2010, 11(10):889-896.

[6] MANTOVANI A, SICA A. Macrophages, innate immunity and cancer: Balance, tolerance, and diversity[J]. Curr Opin Immunol, 2010, 22(2):231-237.

[7] SICA A, ALLAVENA P, MANTOVANI A. Cancer related inflammation: The macrophage connection[J]. Cancer Lett, 2008, 267(2):204-215.

[8] STANLEY R, HAMILTON LAURI A, AALTONEN. WHO classification tumours of the digestive system[M]. IARC Press Lyon, 2000:9-11.

[9] HU JM, LIU K, LIU JH, et al. The increased number of tumor-associated macrophage is associated with overexpression of VEGF-C, plays an important role in Kazakh ESCC invasion and metastasis[J]. Exp Mol Pathol, 2017, 102(1):15-21.

[10] HU JM, LIU K, LIU JH, et al. CD163 as a marker of M2 macrophage, contribute to predicting aggressiveness and prognosis of Kazakh esophageal squmous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2017, 8(13):21526-21538.

[11] QIAN BZ, POLLARD JW. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis[J]. Cell, 2010; 141(1):39-51.

[12] HU Y, HE MY, ZHU LF, et al. Tumor-associated macrophages correlate with the clinicopathological features and poor outcomes via inducing epithelial to mesenchymal transition in oral squamous cell carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016, 35(1):12.

[13] JENSEN TO, SCHMIDT H, MOLLER HJ, et al. Macrophage markers in serum and tumor have prognostic impact in American Joint Committee on Cancer stage I/II melanoma[J]. J Clin Oncol, 2009, 27(20):3330-3337.

[14] KIM KJ, WEN XY, YANG HK, et al. Prognostic implication of M2 macrophages are determined by the proportional balance of tumor associated macrophages and tumor infiltrating lymphocytes in microsatellite-unstable gastric carcinoma[J]. PLoS One, 2015, 10(12):e0144192.

[15] PARK JY, SUNG JY, LEE J, et al. Polarized CD163+ tumor-associated macrophages are associated with increased angiogenesis and CXCL12 expression in gastric cancer[J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 2015, 40(3):357-365.

[16] XIE R, DONG B, PANG H, et al. Tumor-associated macrophages in esophageal carcinoma and its impact on prognosis[J]. Chin J Clin Oncol, 2011, 38(2):83-86.

[17] WEI Q, FANG W, YE L, et al. Density of tumor associated macrophage correlates with lymph node metastasis in papillary thyroid carcinoma[J]. Thyroid, 2012, 22(9):905-910.

[18] MESSAOUDENE M, PERIER A, FREGNI G, et al. Characterization of the microenvironment in positive and negative sentinel lymph nodes from melanoma patients[J]. PLoS One, 2015, 10(7):e0133363.

[19] PIRILA E, VAYRYNEN O, SUNDQUIST E, et al. Macrophages modulate migration and invasion of human tongue squamous cell carcinoma[J]. PLoS One, 2015, 10(3):e0120895.

[20] KIM S, CHO SW, MIN HS, et al. The expression of tumor-associated macrophages in papillary thyroid carcinoma[J]. Endocrinol Metab(Seoul), 2013, 28(3):192-198.