蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬區(qū)A-β蛋白表達 與認知功能障礙的關聯(lián)研究

何 娟，吳 瓊，李 娜，郝璞珩

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科，陜西西安 710061；2. 西安交通大學生物醫(yī)學信息工程教育部 重點實驗室，生命科學與技術學院，陜西西安 710049；3. 西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710077)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)通常是由于腦內動脈瘤破裂導致血液流入蛛網(wǎng)膜下腔而引起的病變，在人類具有高致殘率和高死亡率的特點。SAH的病理過程包括灌注減少、微血栓形成、大腦水腫以及遲發(fā)性腦缺血，繼而引起不同程度的感覺、運動、認知等方面功能損傷[1-2]。A-β是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)在溶酶體、高爾基體、內質網(wǎng)的異常代謝產物。A-β表達增加，沉積在新皮質、杏仁核及海馬等部位，可以導致神經(jīng)元損傷及認知功能減退[3-4]。近年來A-β對神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究頗多，但大多集中于阿爾茲海默病的認知功能的研究，對于SAH后認知功能障礙與A-β的關系研究尚少。

本實驗通過前瞻性研究, 對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠海馬組織A-β蛋白表達及認知功能的動態(tài)變化進行觀察，探討其與病情及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 江蘇醫(yī)療器械廠生產的解剖剪、眼科剪、刀柄刀片、顯微有齒鑷及無齒鑷、三角針及小圓針；Olympus BX51 熒光顯微鏡(日本)。

A-β1-40單克隆抗體(美國Bioword Technology公司)；生物素化山羊抗小鼠抗體、封閉用正常羊血清、DAB顯色試劑盒、辣根酶標記鏈酶卵白素(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 實驗動物 成年健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠48只，體質量250～280 g，購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心。于實驗動物中心SPF環(huán)境下飼養(yǎng)，統(tǒng)一喂養(yǎng)配制的鼠糧和水，飼養(yǎng)1周后進行實驗。隨機分為假手術組和模型組，每組又分為3、7、14、28 d 4個亞組。

1.3 大鼠SAH模型的建立 參照Bederson法[5]，采用刺破頸內動脈法建立SD大鼠SAH模型。采用3-0單股的直徑0.2 μm、長50 mm尼龍線將頭端鈍化，于距頭端18.5 mm處作標記，750 mL/L乙醇清潔后放置在肝素化的生理鹽水中備用。SD大鼠稱重后用100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后取仰臥位固定，取腹側頸部正中切口，鈍性分離軟組織后暴露右側頸總動脈和頸動脈分叉處，分離頸內動脈和頸外動脈，結扎并切斷頸內動脈和頸外動脈之間的吻合支，然后將頸外動脈結扎并切斷，將其尾端拉直與頸內動脈成一條直線，用直徑為0.2 μm鈍化后的尼龍線從頸外動脈插入頸內動脈顱內段，插入深度約為18.5 mm，使線插進大腦中動脈開口處，感覺到阻力時再快速前進3 mm刺破血管，制造SAH模型。15 s后迅速將尼龍線拔出，并扎緊頸外動脈斷端，縫合皮膚切口。假手術組大鼠除了不刺破血管壁外，其余操作均與模型組一致。2組大鼠均于麻醉蘇醒后繼續(xù)于實驗動物中心SPF實驗室中飼養(yǎng)，正常喂食和水。

1.4 Morris水迷宮實驗流程 使用自制的Morris水迷宮裝置，主要由盛水的圓形水池(直徑140 cm，高60 cm)和一個可移動位置的黑色平臺(直徑10 cm，高35 cm)組成。水池壁上標有東、南、西、北4個注水點，4個注水點將水池劃分為4個象限，注水深度為40 cm，使用少量墨汁將水染黑。本實驗選取第1象限中央放置移動平臺。分別于術后3、7、14、28 d進行水迷宮檢測。每只大鼠分別于4個象限的同一位置放入水池，分別計算4個象限到達平臺的時間，計算4個象限到達平臺的時間均數(shù)為逃避潛伏期時間，撤離平臺后計算大鼠在原象限滯留的時間之和為象限滯留時間。

1.5 取材行A-β免疫組化染色 用100 g/L水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，繼而開胸，將針頭由左心室插入主動脈，使用止血鉗固定，同時剪開右心耳。生理鹽水200 mL進行灌注，再使用40 g/L多聚甲醛200 mL進行灌注。然后快速取下全腦組織，將全腦組織用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，取視交叉后0.54～6.54 mm區(qū)域制作常規(guī)石蠟包埋切片，行A-β(滴度1∶100)免疫組化染色，貼片封蠟。

2 結 果

2.1 2組大鼠逃避潛伏期的比較 手術前所有大鼠神經(jīng)功能均正常，模型組與假手術組逃避潛伏期時間無明顯差異(P>0.05)。造模后相應時間點，模型組比假手術組逃避潛伏期時間明顯延長(P<0.05)，象限滯留時間明顯減少(P<0.05，表1)。

2.2 2組A-β蛋白表達的比較 免疫組化染色結果顯示，A-β標記的神經(jīng)元，以細胞核含有棕黃色的顆?；虬咂臑殛栃?。模型組在造模后3、7、14 d的A-β陽性細胞計數(shù)持續(xù)升高，14 d達到峰值，28 d的A-β陽性細胞計數(shù)較前下降。在7、14、28 d時，模型組與假手術組的A-β陽性細胞計數(shù)具有統(tǒng)計學差異(P<0.05，表2、圖1)。

表1 2組大鼠逃避潛伏期時間和象限滯留時間的比較

與相應時間點假手術組比較，*P<0.05。

表2 2組大鼠A-β陽性細胞計數(shù)的統(tǒng)計比較

與相應時間點假手術組比較，*P<0.05。

圖1 各組大鼠海馬部位A-β陽性表達

Fig.1 Positive expression of A-β peptide in the hippocampus of rats (×400)

A：假手術組；B、C、D、E：分別是模型組3、7、14、28 d時間點亞組。

3 討 論

SAH的病理過程包括微循環(huán)灌注減少、大腦水腫、血栓形成以及遲發(fā)性腦缺血等，而腦血管痙攣是SAH的主要并發(fā)癥，使得發(fā)病后2周患者的死亡率增加1.5～2倍[6]。血管痙攣造成顱內動脈血管收縮，導致血流量絕對減少，繼而引起腦組織灌注不足，從而產生嚴重的缺血缺氧性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，甚至會導致缺血性腦組織壞死[7]。本實驗選取SD大鼠，在SAH造模后對神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙中的認知功能改變及相應組織化學指標A-β變化進行觀察，探討與病情變化及預后的關系。

臨床癡呆的患者，在患病早期一般先出現(xiàn)遺忘型輕型認知功能障礙，表現(xiàn)為記憶力損害[8]。運用水迷宮來評定大鼠認知功能中的記憶功能是比較恰當?shù)摹Ｋ詫m試驗中發(fā)現(xiàn)，造模前2組大鼠的逃避潛伏期統(tǒng)計無明顯差異，造模后模型組大鼠尋找平臺的軌跡表現(xiàn)為隨機性，表明其學習記憶能力有所下降；而假手術組大鼠在經(jīng)過幾次訓練后，大鼠的記憶功能得到強化，逐漸轉為直線到達。模型組大鼠水迷宮潛伏期時間較假手術組明顯延長，尋找平臺錯誤的次數(shù)較假手術組明顯增多，相應時間點均具有統(tǒng)計學差異。同一時間點空間探索的時間，模型組和假手術組大鼠分別在4個象限內尋找到平臺時間無明顯差異，但模型組比假手術組尋找平臺的平均時間明顯延長。撤離平臺后大鼠的象限滯留時間模型組較假手術組明顯減少。由此可見，模型組的大鼠出現(xiàn)明顯空間學習記憶功能下降。

近年來，A-β在神經(jīng)變性疾病中的作用備受關注，其在阿爾茨海默病中的研究較為深入，而在SAH所導致的生理、病理過程中的作用卻少有研究。A-β是淀粉樣前體蛋白，在正常的老年人腦組織中也存在，但其含量很低，是神經(jīng)元和膠質細胞正常代謝的產物。正常生理條件下，A-β的產生、降解和清除是一個動態(tài)平衡過程，當發(fā)生基因突變或代謝因素、環(huán)境因素改變等作用，引起A-β表達增加、細胞外酶降解水平降低或轉運至腦外機制受阻，進而在腦組織中沉積增加，導致神經(jīng)元損傷進而引起認知功能減退。研究顯示A-β具有神經(jīng)毒性作用，促進細胞膜磷脂超氧化，并抑制磷酸化過程，最終導致細胞損傷和死亡[3-4]。

但認知功能障礙與中樞神經(jīng)系統(tǒng)哪些部位受損密切相關呢？近年研究顯示，海馬接受大腦皮質傳遞的信息并進行選擇性儲存及記憶，而海馬特別是海馬的中區(qū)是對缺血性損傷最為敏感的腦區(qū)之一。目前研究認為，海馬這種選擇性缺血易損性與學習、記憶功能障礙密切相關，可能是癡呆的病理生理基礎之一。而SAH會繼發(fā)明顯的血管痙攣，繼而引起神經(jīng)元損傷，是癡呆的重要病理形態(tài)學基礎，海馬區(qū)錐體細胞也經(jīng)歷了缺血、水腫等改變，逐漸發(fā)展為基質疏松、微空泡形成、損傷脫失。因此，本實驗選擇海馬作為觀察區(qū)。目前的研究已經(jīng)證實，A-β是大腦皮質老年斑的核心成分，也是認知功能障礙病理改變的特征性成分。在腦內產生的A-β主要通過細胞內吞、細胞外酶降解和轉運出腦等途徑得以清除，一般不會對機體產生影響，但其堆積過多時這種平衡被打破，繼而沉積在杏仁核、海馬及新皮質等區(qū)域[8-10]。

本實驗顯示，模型組海馬局部神經(jīng)元出現(xiàn)神經(jīng)元纖維走行紊亂且大片缺失，并出現(xiàn)增粗、腫脹、斷裂等損害表現(xiàn)，且A-β標記的神經(jīng)元較假手術組明顯增多，說明海馬區(qū)的A-β沉積是病理發(fā)生的早期關鍵事件，引發(fā)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元退行性變的惡性循環(huán)及級聯(lián)放大的病理生理系統(tǒng)。本實驗模型組海馬區(qū)神經(jīng)元A-β表達明顯增多，結合其逃避潛伏期延長，我們推測SAH大鼠繼發(fā)血管痙攣后神經(jīng)細胞損傷繼而認知功能下降可能與以下機制有關[9-11]：①神經(jīng)元對各種傷害性刺激如缺血缺氧、炎性反應、自由基損傷、氧化應激等的敏感性增強，從而導致神經(jīng)元凋亡及壞死；②缺血缺氧損傷后，血腦屏障受到破壞，引起A-β基因被激活而過表達，同時細胞內吞、細胞外酶降解和轉運出腦等清除功能下降，A-β在腦內不斷蓄積，經(jīng)一系列的關聯(lián)反應，最終導致神經(jīng)元損傷及認知功能障礙。

由于A-β具有不同亞型，且實驗的不同濃度等因素對結果有一定影響，并且神經(jīng)元相互作用涉及到多條路徑，所以其具體機制還需要進一步的研究。

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