子宮內(nèi)膜癌干細胞分化過程中microRNA表達譜的 鑒定及分析

王 偉，王 臻，黃康榕，王月玲，柏海燕，楊新園

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710061；2. 陜西省婦幼保健院，陜西西安 710003； 3. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安 710061)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer, EC)是最常見的婦科惡性腫瘤之一。由于肥胖、生活方式改變、女性平均壽命延長及雌激素濫用等因素影響，EC的發(fā)病率逐年上升，并呈年輕化趨勢[1-2]。目前認為腫瘤組織由3種細胞成分構(gòu)成：具有無限增殖能力并可形成新的腫瘤克隆的腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)、可有限增殖但不能形成新的腫瘤克隆的腫瘤細胞及上述兩種能力都喪失的腫瘤細胞，其中只有腫瘤干細胞才是腫瘤發(fā)生的初始驅(qū)動細胞，腫瘤的轉(zhuǎn)移也是腫瘤干細胞選擇適宜組織器官“定位”的過程。在EC中也已證實子宮內(nèi)膜癌干細胞(endometrial cancer stem cells, ECSCs)的存在[3]，CD133是最先用于分離ECSCs的標志物[4]。此外，ECSCs高表達Musashi-1和Nanog基因[5]，也有學(xué)者應(yīng)用細胞生物學(xué)特性(如側(cè)群細胞法)對其進行分離鑒定。ECSCs在EC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。對EC干細胞的特性研究顯示，ECSCs具有明顯的耐化療性和耐放療性，是導(dǎo)致EC治療失敗及復(fù)發(fā)的主要因素[6-7]。因而，探索EC干細胞的生物學(xué)特性對于從根本上抑制EC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)，改善患者預(yù)后具有重大意義。

microRNAs(miRNAs)是一類大小為20～25個堿基的內(nèi)源性非編碼RNA分子，具有調(diào)節(jié)基因表達活性的功能。miRNAs與腫瘤干細胞關(guān)系密切，可通過調(diào)節(jié)其蛋白、相關(guān)基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。如miR-302抑制細胞周期蛋白E-CDK2、D-CDK4/6通路，加強G1期阻滯通路，導(dǎo)致干細胞致瘤性降低；miRNA-199b-5p作用于Notch信號通路而調(diào)控CSC的自我更新能力；let-7負調(diào)控下游靶基因H-RAS，抑制CSC的自我更新；miRNA-135a過表達促進CSC自我更新導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[8-10]。但迄今為止，ECSCs相關(guān)miRNAs研究甚少，已有研究報道，micRNA-101通過作用于靶基因EZH2、MCL-1和FOS，抑制EC細胞增殖、侵襲能力及干細胞表型[11]；miRNA-134在EC干細胞和癌細胞之間存在顯著差異，通過抑制POGLUT1蛋白表達進而抑制EC干細胞的增殖和遷移[12]。但在EC干細胞分化過程中有哪些miRNAs起到關(guān)鍵性作用尚不明確。本研究通過無血清懸浮培養(yǎng)法富集EC干細胞，篩選EC干細胞分化過程中差異表達的miRNAs，為深入探討EC干細胞的分化機制提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑 子宮內(nèi)膜癌HEC-1-B細胞購自上海江林生物有限公司。DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco, USA)、胎牛血清(Hyclone, USA)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor, EGF, Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(insulin transferrin selenium, ITS, Gibco, NY, USA)、成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF, Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)、0.5 g/L及2.5 g/L胰蛋白酶/EDTA(Sigma, USA)、Anti-CD133-PE(Miltenyi Bio, Germany)、Trizol Reagent(Invitrogen, USA)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒(TaKaRa, Japan)。

1.2 細胞培養(yǎng) 富集腫瘤干細胞：取對數(shù)生長期的HEC-1-B細胞，以5.0×105/mL的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，待貼壁后換液為無血清培養(yǎng)基，即DMEM/F12含10 ng/mL EGF、20 ng/mL bFGF和10 g/L ITS，在37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，當(dāng)逐漸形成較大的腫瘤球后，經(jīng)濾網(wǎng)過濾收集細胞球用于后續(xù)實驗。

腫瘤干細胞的分化：將富集到的細胞球，重懸于含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，每2～3 d 換液。

1.3 細胞表型分析 將富集的EC干細胞，用0.5 g/L胰酶-EDTA消化為單細胞懸液后調(diào)整細胞密度至1.0×107/mL，300 μL緩沖液重懸細胞，分別加入CD133-PE及FcR Blocking阻斷劑，lgG-PE抗體做為陰性對照，4 ℃避光孵育30 min，適量緩沖液重懸后流式細胞儀檢測細胞表型。

1.4 Western blot檢測 檢測ECSCs及其分化第10天的細胞干性相關(guān)基因的蛋白表達。提取細胞總蛋白，取40 μg蛋白上樣于100 g/L的SDS-PAGE膠，分離之后轉(zhuǎn)膜于PVDF膜，50 g/L脫脂牛奶封閉，分別加入兔抗人Oct 4、Sox2單克隆一抗(1∶1 000)，4 ℃ 孵育過夜，TBST洗滌后，加入山羊抗兔lgG-HRP二抗室溫孵育1 h。ECL顯色，用成像系統(tǒng)掃描并分析。β-actin作為內(nèi)參照。

1.5 miRNA芯片雜交及數(shù)據(jù)分析 樣品使用Affymetrix公司開發(fā)的 GeneChip?miRNA 4.0 Array進行處理分析。比較ECSCs及其分化細胞間差異表達的microRNAs。miRNA芯片的雜交、掃描與數(shù)據(jù)分析均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司技術(shù)服務(wù)部完成。

1.6 RT-qPCR檢測 用RNA提取試劑盒提取EC干細胞及其分化細胞的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL為PCR擴增模板。用SYBR Green PCR Master Mix在PCR儀定量分析。用GAPDH進行歸一化處理。

1.7 生物信息學(xué)分析 依據(jù)Fold Change值、P值及ForeGround值選擇有顯著性差異表達的miRNAs，應(yīng)用Targetscan、miRTarBase及miRanda數(shù)據(jù)庫進行生物信息學(xué)分析，預(yù)測差異表達的miRNAs的靶基因。

1.8 檢測差異表達的基因 采用Affymetrix基因表達譜芯片尋找ECSCs及其分化細胞間的差異基因，基因芯片的雜交、掃描與數(shù)據(jù)分析均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司技術(shù)服務(wù)部完成。

2 結(jié) 果

2.1 ECSCs的富集和分化 HEC-1-B細胞傳代貼壁后更換為無血清培養(yǎng)液，除少數(shù)細胞繼續(xù)存活生長外，大部分細胞逐漸凋亡。培養(yǎng)48 h后細胞形成由幾個到十幾個細胞組成的微球，這種細胞球體積小，結(jié)構(gòu)松散，形態(tài)不規(guī)則(圖1A)。此后細胞球緩慢增大，經(jīng)過10～12 d的培養(yǎng)，形成數(shù)百個細胞組成的腫瘤球，細胞間連接緊密，難以區(qū)分細胞間的界限，呈圓形或橢圓形(圖1B)。

將腫瘤球用含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，可重新貼壁生長，腫瘤球邊緣最先貼壁，細胞呈單層逐漸鋪開，細胞大小均勻，扁平規(guī)則，細胞邊界清楚，折光性好，細胞間連接緊密，排列規(guī)則(圖1C)。

圖1 富集子宮內(nèi)膜癌干細胞及其分化培養(yǎng)

Fig.1 The tumorsphere formation from HEC-1-B cells and ECSCs’ differentiation

A：初期培養(yǎng)的腫瘤球；B：培養(yǎng)10 d的腫瘤球；C：分化3 d的ECSCs。

2.2 ECSCs鑒定 流式細胞儀檢測腫瘤球特異性表面分子CD133的表達，結(jié)果顯示CD133的表達為(97.0±2.5)%(圖2A、B)。Western blot檢測腫瘤球及其分化第10天的細胞中Sox2和Oct4的表達水平，結(jié)果顯示腫瘤球中Sox2和Oct4的表達水平明顯高于其分化細胞，并隨著分化時間的延長逐漸下降(圖2C)。

2.3 miRNA芯片檢測結(jié)果 ECSCs與其分化細胞間有57個miRNAs的表達存在差異，其中差異倍數(shù)大于2的miRNAs共有11個，10個在ECSCs中高表達，包括miR-522、miR-139-3p、miR-520c-5p、miR-518d-5p、miR-146b-5p、miR-34a、miR-526a、miR-193a-3p、miR-221、miR-4674；1個miRNA(即miR-760)在ECSCs中低表達(圖3)。

圖2 子宮內(nèi)膜癌干細胞的鑒定

Fig.2 Identification of ECSCs

A、B：流式細胞儀檢測腫瘤球CD133的表達；C：Western blot檢測腫瘤球及其分化細胞Sox2和Oct4的表達水平。

圖3 miRNA聚類分析圖

Fig.3 Hierachical clustering analysis of miRNA expression profile

綠色代表miRNA表達下調(diào)，紅色代表miRNA表達上調(diào)。

2.4 RT-qPCR驗證miRNA芯片結(jié)果 對有顯著差異的11個miRNAs進行RT-qPCR驗證，其中miR-522、miR-139-3p、miR-520c-5p、miR-518d-5p、miR-146b-5p、miR-34a、miR-193a-3p、miR-221、miR-760的表達情況與芯片檢測結(jié)果一致，miR-526a、miR-4674的表達與芯片檢測結(jié)果不一致(圖4)。

2.5 差異表達的miRNAs生物信息學(xué)分析 為提高預(yù)測的特異性，采用Targetscan、miRTarBase及miRanda在線數(shù)據(jù)庫對差異表達的miRNAs的靶基因進行預(yù)測。 結(jié)果顯示，3個數(shù)據(jù)庫的交集中差異表達的miRNAs均可預(yù)測到靶基因。

2.6 基因芯片結(jié)果 基因芯片檢測結(jié)果顯示，在ECSCs與其分化細胞間有1 766個差異表達的基因。共445個基因有顯著性差異(差異倍數(shù)>2，P<0.05)，其中207個在ECSCs中高表達，238個在ECSCs中低表達(圖5)。

圖4 miRNAs在RT-qPCR和miRNA芯片的表達差異倍數(shù)

Fig.4 RT-qPCR analyses validated the miRNA microarray results

圖5 差異基因聚類分析圖和散點圖

Fig.5 Analysis of differential gene expressions

A：差異基因聚類分析圖；B：差異基因散點圖。

2.7 數(shù)據(jù)綜合分析 將預(yù)測的miRNAs靶基因與差異基因表達譜進行綜合分析，結(jié)果顯示除miR-139-3p外，預(yù)測的miRNAs靶基因與差異基因表達譜有交集(表1)。

表1 miRNAs的預(yù)測靶基因與差異基因表達譜綜合分析

Tab.1 Analysis of the predicted target genes of miRNAs and gene expressions

差異表達miRNAs預(yù)測的靶基因與差異基因表達譜有交集的基因miR-522FANCD2,IL1RAP,C10orf118,MLL3,BRCA1,ELAVL1,SLC12A6,SYNC,TBC1D8,ANO1,CLVS1,WDR26,DYRK2,RTKN2,ETV1,MED13LmiR-518d-5pEWSR1,CYLD,ZSWIM6,ZFYVE1,ZFP36L1miR-520c-5pEWSR1,CYLD,ZSWIM6,ZFYVE1,ZFP36L1miR-146b-5pTDRKH,HNRNPD,ESYT2,PCDH1,C4orf3miR-760ZSW,IM6,SHMT2,TNIP1,HOXA2,LEPREL1,LMNB2,EPB41,SHCBP1,AP4E1miR-193a-3pNT5E,SOS2,LAMC2,MCL1,PLAU,STMN1miR-221-5pC8orf58,MEX3B,ASPH,SLC7A6,ARMCX3,PRNP,INSIG2,SLC41A2,SUV39H1,JAK2,SEPSECS,AK2,CEACAM1,B4GALT5,CHD2,PRICKLE1,TMEM201,CDCA5,SDC4,TMEM92,ZKSCAN1,MRPL35,SMG5,RRAGD,BCL2L13,TEP1,IRAK2,UBIAD1miR-34aRGS17,ACSL4,CDKN1C,KIAA1217,NOTCH1,TP53INP2,CPD,CCNE2,COL12A1,PTPRD,FRMD4AmiR-526aEWSR1,CYLD,ZSWIM6,ZFYVE1,ZFP36L1miR-4674NGEF

3 討 論

EC干細胞具有自我更新的能力和高致瘤性，與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有著密切關(guān)系，了解ECSCs的生物學(xué)特性并設(shè)法殺死腫瘤干細胞是目前研究的焦點問題。DONTU等[13]采用無血清懸浮培養(yǎng)的方式富集乳腺癌干細胞，該方法在許多腫瘤細胞系中均可培養(yǎng)出腫瘤干細胞球，本研究采用同樣的方法成功富集了EC干細胞。使細胞適應(yīng)無血清環(huán)境有2種方法：一種是將細胞直接從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至無血清培養(yǎng)基中直接適應(yīng)，另一種是梯級降低血清濃度直至無血清培養(yǎng)，后者是較為符合細胞生理條件的方法。但本實驗在需要保持腫瘤干細胞干性同時又必須增加腫瘤干細胞數(shù)量用于下一步實驗，因此，采用直接適應(yīng)的方法以較高細胞密度接種至細胞培養(yǎng)皿中換液為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。在富集ECSCs的過程中，如何使細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，同時避免腫瘤干細胞喪失干性并發(fā)生分化是本研究關(guān)注的重點。本研究使用添加了生長因子的無血清培養(yǎng)基，添加生長因子的質(zhì)量濃度為10 ng/mL EGF和20 ng/mL bFGF，該濃度對干細胞的促增殖作用最強。ITS包含胰島素、人轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸，10 g/L ITS可促進細胞增殖并減少細胞對血清的需求。應(yīng)用ECSCs表面標志物CD133，結(jié)合干細胞特異性的標志物Sox2和Oct4對富集的腫瘤球進行鑒定，發(fā)現(xiàn)腫瘤球中CD133高表達，同時Sox2和Oct4的表達水平隨分化時間的延長明顯降低，提示富集的腫瘤球沒有干細胞表面標志物的丟失，沒有發(fā)生分化現(xiàn)象，說明無血清懸浮培養(yǎng)法確實可以用于富集ECSCs。

腫瘤干細胞一方面可以自我復(fù)制保持“干性”，另一方面也可以分化成腫瘤細胞以促進腫瘤生長。在多種腫瘤中有異常表達的miRNAs，很多miRNAs作為腫瘤標志物或預(yù)測因子用于腫瘤診斷和預(yù)測腫瘤預(yù)后[14-16]。近年的研究多側(cè)重于腫瘤組織中miRNAs的研究[17-19]，而腫瘤干細胞分化過程中miRNAs表達譜的研究未見報道。分析腫瘤干細胞分化過程中miRNAs的差異，是深入了解腫瘤干細胞的功能與特性的有效途徑。本研究結(jié)果顯示，ECSCs分化過程中有部分miRNAs發(fā)生了顯著性變化。有關(guān)miRNAs表達譜如何與細胞功能相聯(lián)系涉及miRNAs表達譜與其靶基因的研究。本研究首先利用Targetscan等數(shù)據(jù)庫對差異表達的miRNAs進行靶基因的預(yù)測，但僅通過結(jié)合域結(jié)構(gòu)預(yù)測的靶基因不一定在細胞內(nèi)都能常態(tài)表達。任何調(diào)控因素的變化最終都將反映在調(diào)控目標的表達水平的變化上，兩方面變化因素缺一不可，即只有miRNAs表達水平的變化而沒有目標基因表達水平的變化，無法形成細胞功能的變化；同樣，只有目標基因的變化，沒有miRNAs的變化，說明可能是miRNAs調(diào)控手段以外因素在發(fā)揮作用。我們將miRNAs表達譜與基因表達譜結(jié)合起來分析研究可去除以上兩種情況，將變化有相關(guān)性的miRNAs和靶基因篩選出來。在腫瘤干細胞分化過程中異常表達的miRNAs及其靶基因可能在腫瘤干細胞的干性維持及分化中發(fā)揮重要作用，但仍需在功能學(xué)方面進一步研究，這將為深入了解EC干細胞特性提供新的思路。

[1] SIEGEL R, MA J, ZOU Z, et al. Cancer statistics, 2014, CA[J]. Cancer J Clin, 2014, 64(1):9-29.

[2] SMITH RA, MANASSARAM-BAPTISTE D, BROOKS D, et al. Cancer screening in the United States, 2015: A review of current American cancer society guidelines and current issues in cancer screening[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(1):30-54.

[4] DING DC, LIU HW, CHANG YH, et al. Expression of CD133 in endometrial cancer cells and its implications[J]. J Cancer, 2017, 8(11):2142-2153.

[5] G?TTE M, GREVE B, KELSCH R, et al. The adult stem cell marker Musashi-1 modulates endometrial carcinoma cell cycle progression and apoptosis via Notch-1 and p21WAF1/CIP1[J]. Int J Cancer, 2011, 129(8):2042-2049.

[6] MCCONECHY MK, TALHOUK A, LEUNG S. et al. Endometrial carcinomas with POLE exonuclease domain mutations have a favorable prognosis[J]. Clin Cancer Res, 2016, 22(12):2865-2873.

[7] 鄒雅婷，陳勍. 腫瘤干細胞與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系研究進展[J]. 國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志, 2017, 44(1):35-39.

[8] 程文，高建平，張征宇. 微小RNA與腫瘤相關(guān)性研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2011, 24(2):203-205.

[9] 宓林，于曉峰，鄒健. 微小RNA對腫瘤干細胞的調(diào)控機制[J]. 國際消化病雜志, 2011, 31(3):163-165.

[10] 潘運寶，楊惠玲. miRNA與腫瘤干細胞的研究進展[J]. 國際內(nèi)科學(xué)雜志, 2009, 36(9):548-550.

[11] KONNO Y, DONG P, XIONG Y. MicroRNA-101 targets EZH2, MCL-1 and FOS to suppress proliferation, invasion and stem cell-like phenotype of aggressive endometrial cancer cells[J]. Oncotarget, 2014, 5(15):6049-6062.

[12] GAO Y, LIU T, HUANG Y. MicroRNA-134 suppresses endometrial cancer stem cells by targeting POGLUT1 and Notch pathway proteins[J]. FEBS Lett, 2015, 589(2):207-214.

[13] DONTU G, Al-HAJJ M, ABDALLAH WM, et al. Stem cells in normal breast development and breast cancer[J]. Cell Prolif, 2003, 36(Suppl 1):59-72.

[14] BRAZA BOILS A, MARI ALEXANDRE J, GILABERT J, et al. MicroRNA expression profile in endometriosis: Its relation to angiogenesis and fibrinolytic factors[J]. Hum Reprod, 2014, 29(5):978-988.

[15] DEVOR EJ, HOVEY AM, GOODHEART MJ, et al. microRNA expression profiling of endometrial endometrioid adenocarcinomas and serous adenocarcinomas reveals profiles containing shared, unique and differentiating groups of micoRNAs[J]. Oncol Rep, 2011, 26(4):995-1002.

[16] TORRES A, TORRES K, PESCI A, et al. Diagnostic and prognostic significance of miRNA signatures in tissues and plasma of endometrioid endometrial carcinoma patients[J]. Int J Caner, 2013, 132(7):1633-1645.

[17] LI Q, YAO Y, EADES G，et al. Downregulation of miR-140 promotes cancer stem cell formation in basal-like early stage breast cancer[J]. Oncogene, 2014, 33(20):2589-600.

[18] LIU J, RUAN B, YOU N, et al. Downregulation of miR-200a induces EMT phenotypes and CSC-like signatures through targeting the β-catenin pathway in hepatic oval cells[J]. PLoS One, 2013, 8(11):e79409.

[19] FAN X, CHEN X, DENG W, et al. Up-regulated microRNA-143 in cancer stem cells differentiation promotes prostate cancer cells metastasis by modulating FNDC3B expression[J]. BMC Cancer, 2013, 13:61.