Affymetrix基因芯片測(cè)序技術(shù)分析垂體對(duì) 大鼠椎動(dòng)脈型頸椎病模型的調(diào)控機(jī)制

宋 敏，鞏彥龍，劉 濤，劉建鴻，董萬(wàn)濤，劉小鈺，侯紅艷

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州 730000；2. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅蘭州 730000)

椎動(dòng)脈型頸椎病(cervical spondylosis of vertebral artery type, CSA)在中醫(yī)學(xué)屬于“眩暈”“項(xiàng)痹”的范疇，好發(fā)于中老年人，男性多于女性，其發(fā)病率約占頸椎病的20%～25%。其發(fā)病是由于頸椎出現(xiàn)不同程度的退化而導(dǎo)致椎-基底動(dòng)脈狹窄[1]，供血量下降，引起顱內(nèi)供血不足，從而出現(xiàn)以眩暈為主要表現(xiàn)，伴有其他頸部及全身不適的臨床綜合征[2-3]。近年來(lái)，隨著人們生活方式改變，CSA的發(fā)病率呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)，并趨向于年輕化。下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axi, HPA軸)是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫(neuro-endocrine-immune, NEI)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分，與CSA的發(fā)病密切相關(guān)。當(dāng)椎動(dòng)脈局部受到刺激時(shí)，機(jī)體應(yīng)激信息在大腦通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)通路激活HPA軸而改變機(jī)體的生理狀態(tài)[4]。在HPA軸的調(diào)控下CSA的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜[5]，椎-基底動(dòng)脈痙攣、血流量下降是CSA的基本發(fā)病機(jī)制，多種因素導(dǎo)致的椎動(dòng)脈血管功能改變是CSA發(fā)生發(fā)展中的主要環(huán)節(jié)。研究基因調(diào)控對(duì)CSA的發(fā)病和治療具有重要價(jià)值。本研究通過(guò)建立CSA大鼠模型，并設(shè)置正常對(duì)照，應(yīng)用基因芯片技術(shù)，分析正常組和模型組大鼠垂體組織基因表達(dá)譜特征，進(jìn)而篩選差異表達(dá)的基因，從基因功能、信號(hào)通路等方面探討垂體對(duì)CSA模型大鼠的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥品 Trizol試劑和ds-cDNA合成試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；單色DNA標(biāo)記試劑盒購(gòu)自美國(guó)Nimble Gen Systems公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自BioTNT公司；Affymetric HumangenomeU 133 plus2.0芯片購(gòu)自Affymetrix公司；NucleoSpin?RNA clean-up試劑盒購(gòu)自MACHEREY-NAGEL(Germany)；PCR NucleoSpinExtract Ⅱ Kit(MN)和RNA Clean-up Kit(MN)購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司；T7 Oligo(dT)Primer上海賓智生物科技有限公司；注射用青霉素鈉160 U/支(華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F5022318)；水合氯醛，規(guī)格100 g/瓶(上海展云化工有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：CAS-302-170)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠10只，10月齡，體質(zhì)量(300±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室[合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001]提供。每日給予充足的水和飼料，適應(yīng)1周，24 h光照明暗各半，每3只飼養(yǎng)在同一籠中，每2 d更換1次墊料，已排除其他環(huán)境因素。

1.3 動(dòng)物造模與分組 大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組和模型組。模型組動(dòng)物均采用復(fù)合造模法(力學(xué)失衡法與植骨壓迫法相結(jié)合)[6]建立CSA大鼠模型；造模成功后兩組分別隨機(jī)取出4只進(jìn)行基因芯片檢測(cè)。

1.4 組織取材 造模成功后分別解剖分離CSA模型組大鼠及正常組大鼠垂體組織，于液氮中速凍待送檢測(cè)。

1.5 RNA提取及純化 應(yīng)用Trizol法提取大鼠垂體組織樣品中總RNA；使用NanoDropND-1000進(jìn)行質(zhì)檢；根據(jù)RNeasy MiNi Protocol，使用QLAGENR Neasy?Kit純化Total RNA。

1.6 基因芯片檢測(cè) 應(yīng)用Agilent mRNA大鼠全基因單通道表達(dá)譜芯片，由北京博奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 芯片數(shù)據(jù)由北京博奧生物技術(shù)有限公司生物芯片分析系統(tǒng)(MAS系統(tǒng))進(jìn)行歸一化整理，對(duì)歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，將差異基因以上調(diào)及下調(diào)2倍為限，通過(guò)DAVID(the database for annotation, visualization and integrated discovery)網(wǎng)站整合的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體論(gene ontology, GO)、KEGG pathway分析差異基因在信號(hào)通路上的富集程度、分子功能和生物學(xué)過(guò)程；兩組組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣品質(zhì)量控制 8個(gè)待測(cè)樣本中A260/280均在1.8～2.0之間，RNA總量≥1 μg，待測(cè)樣本符合芯片實(shí)驗(yàn)要求(表1)。

經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性的結(jié)果顯示：有清晰可見(jiàn)的28S、18S條帶，12號(hào)RNA樣品28S∶18S rRNA條帶亮度略小于1∶1，樣品有輕微降解；其余RNA樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近1∶1(圖1)。

2.2 基因表達(dá)譜分析

2.2.1 差異基因分析 基于R語(yǔ)言和BRB語(yǔ)言，模型組與正常組垂體組織之間的基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因的篩選，總共有203個(gè)基因上調(diào)、118個(gè)基因下調(diào)(圖2)，聚類分析熱圖中紅色方塊表示|fold change︱=2.205(>2)，OR方法修正后的P=0.017(≤0.05)的差異表達(dá)基因。

2.2.2 CSA模型組大鼠與正常組大鼠垂體組織差異基因表達(dá)譜構(gòu)成的散點(diǎn)圖 見(jiàn)圖3。

2.2.3 GO分析 使用DAVID對(duì)CSA模型組與正常組大鼠垂體組織比較獲得的差異基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示，1 181個(gè)GOs被上調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)，其中包括GO BP(biological process)944條、GO CC(cellular componen)111條、GO MF(molecular function)126條。在此分析中，主要針對(duì)GO BP進(jìn)行分析，并且P值越小，該條GO Term越有意義，其中與調(diào)節(jié)CSA有相關(guān)聯(lián)系的GO Term主要包括對(duì)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)調(diào)節(jié)、神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)、對(duì)外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)、凝血功能的調(diào)節(jié)、血管形成、酶活性的調(diào)節(jié)等；113個(gè)GOs被下調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)，其中包括GO BP 49條、GO CC 37條、GO MF 27條。其中較為有意義的GO Term主要包括對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)、糖皮質(zhì)激素刺激、離子通道活性的調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)行為的調(diào)節(jié)等。圖4和表2為最有意義的部分差異基因所參與的GO功能及注釋。

表1 評(píng)估RNA量和RNA質(zhì)量

Tab.1 Assessment of RNA quantity and RNA quality

序號(hào)樣品編號(hào)A260/280A260/230質(zhì)量濃度(μg/μL)總量(μg)樣品質(zhì)量描述3C51.900.980.1153.9RNA基本完好6C61.871.160.2468.8RNA基本完好9C71.981.270.2127.5RNA基本完好12C81.961.780.2127.5RNA基本完好15Z51.980.830.29410.5RNA基本完好18Z61.960.530.2388.5RNA基本完好21Z71.981.140.2398.5RNA基本完好24Z81.910.960.5155.2RNA基本完好

Z為正常組垂體組織； C為模型組垂體組織。

圖1 變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA樣本的完整性

Fig.1 Detection of RNA sample integrity by denaturing agarose gel electrophoresis

數(shù)字代表樣品編號(hào)，M泳道Hela Cell Control RNA。

圖2 CSA模型組大鼠與正常組大鼠垂體組織聚類分析熱圖

Fig.2 Clustering analysis thermogram of pituitary tissue of rats in the CSA model and the normal group

紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因；黑色：無(wú)差異基因。

圖3 CSA模型組大鼠與正常組大鼠垂體組織差異基因表達(dá)譜構(gòu)成的散點(diǎn)圖

Fig.3 Scatter plot of the gene expression profile of the pituitary tissue in the CSA model group and the normal group

2.2.4 信號(hào)通路分析 將CSA模型組與正常組大鼠垂體組織比較所得到的差異基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，結(jié)果顯示，上調(diào)的差異基因共調(diào)控96條信號(hào)通路(圖5A)，主要涉及神經(jīng)活性的配體-受體相互作用、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、ECM受體相互作用等。下調(diào)的差異基因共調(diào)控48條信號(hào)通路(圖5B)，

圖4 模型組與正常組垂體組織差異基因所調(diào)控的部分GOs

Fig.4 Part of GOs regulated by pituitary tissue differential genes in the model group and the normal group

A：上調(diào)的差異基因所調(diào)控的部分GOs；B：下調(diào)的差異基因所調(diào)控的部分GOs。

表2 差異基因GO功能注釋結(jié)果

Tab.2 GO function annotation results of the differential genes

差異基因GOTermGO名稱基因數(shù)P值GO過(guò)程中部分基因名稱上調(diào)GO:0004871細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)170.007581Hdgfl1、Rgs18、Igbp1bGO:0007186G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)調(diào)節(jié)150.002007Olr1330、Irx5GO:0042551神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)110.006243Foxb1、Irx3GO:0006950對(duì)外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)110.008009Nr4a2、Dpep3GO:0007596凝血功能的調(diào)節(jié)90.010686F2rl2、PdiltGO:0001569血管形成70.001258Pitx2、Cd36GO:0008233酶活性的調(diào)節(jié)50.017034RGD1308751下調(diào)GO:0007049調(diào)節(jié)細(xì)胞周期120.019939Ist1、Obfc1、Wdr12GO:0035690細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)70.011801Tlr3、Med17GO:0012505調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)50.011539Trpc2、Grm1GO:0031960糖皮質(zhì)激素刺激50.011464Gnrh1GO:0005216離子通道活性的調(diào)節(jié)40.000082Kcnd3、Hils1GO:0007626調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)行為30.009132Apba2

圖5 垂體組織組間比較所得到的差異基因所調(diào)控的信號(hào)通路

Fig.5 Pituitary tissue was compared with the resulting differential gene regulated by the signaling pathway

A：上調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)的信號(hào)通路；B：下調(diào)的差異基因調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。

為T(mén)oll樣受體信號(hào)通路、凝血酶受體信號(hào)通路、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、RAL/RAN/ARF信號(hào)通路等。表3為部分差異基因所調(diào)控的信號(hào)通路及注釋。

表3 差異基因KEGG通路注釋

Tab.3 Annotation of differential gene KEGG pathway

差異基因信號(hào)通路P值基因數(shù)通路中部分基因名稱上調(diào)神經(jīng)活性的配體-受體相互作用0.01191122F2rl2脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路0.00303117Cd36、Nr4a2TGF-β信號(hào)通路0.00337216Pitx2、Hils1AMPK信號(hào)通路0.00520813Cd、Serpinb10PPAR信號(hào)通路0.00732911Cd36、Kcnd3p53信號(hào)通路0.0026899Rprm、RprmECM受體相互作用0.0031595Cd3下調(diào)Toll樣受體信號(hào)通路0.00375611Tlr3凝血酶受體信號(hào)通路0.0144757F2rlG蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路0.0050747Rgs18、EbfWnt信號(hào)通路0.0014786Gnrh、Pitx2甲狀腺激素信號(hào)通路0.0047385Med17RAL/RAN/ARF信號(hào)通路0.0003693Rgs18

3 討 論

NEI網(wǎng)絡(luò)在CSA發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，存在于NEI系統(tǒng)中的細(xì)胞因子、神經(jīng)肽、細(xì)胞信息物質(zhì)、激素等通過(guò)神經(jīng)、免疫或者體液調(diào)節(jié)以維持機(jī)體的穩(wěn)定性[7]。HPA軸是NEI網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，與CSA的發(fā)病密切相關(guān)，當(dāng)椎動(dòng)脈局部受到刺激時(shí)，椎-基底動(dòng)脈血管屈曲、扭轉(zhuǎn)而發(fā)生痙攣，損傷血管內(nèi)皮，產(chǎn)生無(wú)菌性炎癥刺激，此時(shí)大腦通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)通路接受機(jī)體應(yīng)激信號(hào)而激活HPA軸，機(jī)體的生理狀態(tài)發(fā)生改變。椎-基底動(dòng)脈系統(tǒng)受刺激的同時(shí)具有與HPA軸相似的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，通過(guò)基因調(diào)控組成特異性的、功能協(xié)調(diào)的反饋調(diào)節(jié)回路[8]。

為了進(jìn)一步探討CSA發(fā)病的分子機(jī)制，本研究采用全基因芯片技術(shù)，分析垂體差異基因表達(dá)譜，進(jìn)而分析垂體在CSA發(fā)病過(guò)程中的調(diào)控作用，從生物信息學(xué)角度對(duì)其機(jī)制進(jìn)一步闡釋。模型組和正常組垂體組織差異基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，共有321個(gè)差異基因的表達(dá)，其中表達(dá)上調(diào)的有203個(gè)，表達(dá)下調(diào)的共有118個(gè)(|fold change︱>2，OR方法修正后的P<0.05)，差異基因所調(diào)控的GO Term主要有對(duì)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的調(diào)節(jié)、神經(jīng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)、對(duì)外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)、凝血功能的調(diào)節(jié)、血管形成的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等；參與的信號(hào)通路主要有脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、凝血酶受體信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、RAL/RAN/ARF信號(hào)通路等。

CSA的發(fā)病是機(jī)體神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)共同的作用結(jié)果，其基本病理改變是椎-基底動(dòng)脈供血功能異常和動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)改變，管壁通透性增加，血管舒張功能變化等。LI等[9]報(bào)道變異的Fdgfl1基因能降低極低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、載脂蛋白C水平，與血清高含量高密度脂蛋白引起的頸部動(dòng)脈斑塊疾病相關(guān)，還與缺血性心臟疾病引起的心臟血管功能改變相關(guān)。分布在椎動(dòng)脈及周?chē)M織的交感神經(jīng)，由于長(zhǎng)期遭受血管形態(tài)改變或局部無(wú)菌炎性刺激時(shí)，交感神經(jīng)通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)通路向大腦傳遞應(yīng)激信號(hào)而激活HPA軸。本研究中垂體組織神經(jīng)功能相關(guān)的上調(diào)基因有Foxb1和Irx3等，BILELLA等[10]研究表明，F(xiàn)oxb1基因的表達(dá)參與機(jī)體的多種生理病理過(guò)程，其中包括參與調(diào)節(jié)交感神經(jīng)的功能而進(jìn)一步調(diào)節(jié)血管的舒縮功能，垂體高表達(dá)的Foxb1基因在CSA疾病過(guò)程中與椎-基底動(dòng)脈痙攣有關(guān)，F(xiàn)oxb1也與炎性刺激[11]、神經(jīng)免疫相關(guān)[12]，可參與疾病的免疫反應(yīng)；SCARLETT等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的刺激下，Irx3通過(guò)Notch信號(hào)通路介導(dǎo)在人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEGF)中高表達(dá)，在創(chuàng)傷愈合的過(guò)程中Irx3能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、趨化和浸潤(rùn)，致新血管形成，CSA中椎-基底動(dòng)脈的舒縮功能改變與Irx3調(diào)控的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、血管重構(gòu)有關(guān)。CSA患者血液較正常人粘稠度增高[14]。本研究結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)凝血功能的F2rl2、Pdilt等基因上調(diào)，這與CSA患者血液高凝狀態(tài)有關(guān)，血液相對(duì)呈高凝狀態(tài)，使已受損的血管內(nèi)膜更易附著粘附因子，使椎-基底動(dòng)脈舒縮功能障礙加重；而調(diào)節(jié)內(nèi)膜系統(tǒng)的基因Trpc2和Grm1在垂體組織中表達(dá)下調(diào)，這與椎-基底動(dòng)脈內(nèi)膜活性下降有關(guān)。

垂體組織中上調(diào)的差異基因信號(hào)通路有脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路。脂肪細(xì)胞因子是一類具有血管活性，并在維持血管系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用的激素和細(xì)胞因子[15]，脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路的激活能夠抑制生長(zhǎng)因子引起動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖及遷移。TGF-β信號(hào)通路激活使成纖維細(xì)胞增加ECM的合成與分泌[16]，CSA患者由于椎動(dòng)脈及其周?chē)M織遭受長(zhǎng)期慢性、反復(fù)損傷，引起TGF-β1持續(xù)合成釋放及自我誘生，而使ECM沉積在椎動(dòng)脈及周?chē)M織，形成組織纖維化和瘢痕。AMPK信號(hào)通路激活不僅能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成[17]，而且能導(dǎo)致頸椎周?chē)墓趋兰」δ墚惓18]。PPAR信號(hào)通路激活可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞及單核/巨噬細(xì)胞等增殖遷移，導(dǎo)致早期血管壁硬化[19]。Toll樣受體信號(hào)通路下調(diào)，使炎癥反應(yīng)刺激細(xì)胞產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素的合成而激活HPA軸，這在免疫應(yīng)答的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，垂體細(xì)胞感應(yīng)這種信號(hào)釋放促炎性細(xì)胞因子IL-6、LIF，形成負(fù)反饋糖皮質(zhì)激素回路。Wnt信號(hào)通路能促進(jìn)血管的新生，但在本研究中表達(dá)下調(diào)，這可能與多種激活的信號(hào)通路相拮抗有關(guān)。

本研究成功復(fù)制CSA大鼠模型后，應(yīng)用基因芯片技術(shù)，分析了模型組和正常組大鼠垂體組織基因表達(dá)譜特征，得出大鼠垂體對(duì)CSA的主要調(diào)節(jié)作用，研究方法較新穎，對(duì)闡明CSA發(fā)病機(jī)制和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究及臨床實(shí)際具有一定的指導(dǎo)意義。結(jié)果表明，CSA的發(fā)病作用機(jī)制是多基因、多信號(hào)通路、多功能的綜合方式進(jìn)行調(diào)節(jié)的結(jié)果，垂體的調(diào)控機(jī)制主要通過(guò)對(duì)炎性刺激、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)椎動(dòng)脈功能及內(nèi)膜系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)，這為進(jìn)一步研究CSA的防治提供了線索。但是，垂體對(duì)CSA的調(diào)控乃至HPA軸甚至是整個(gè)NEI網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。中醫(yī)藥治療CSA有明顯的優(yōu)勢(shì)。本課題組下一步將進(jìn)行中醫(yī)藥干預(yù)并應(yīng)用基因芯片技術(shù)，尋找中醫(yī)藥治療CSA具有重要意義的調(diào)控靶點(diǎn)，為臨床治療提供有效的科學(xué)依據(jù)。

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