微濕布條DNA檢驗

葉 娟，趙 敏，章冬青

（1，3.安徽省天長市公安局刑事科學技術室，安徽 天長 239300；2.江蘇省宿遷市沭陽縣公安局，江蘇 沭陽 223600）

目前制約接觸DNA檢驗成功率的瓶頸主要在接觸DNA檢材的發(fā)現(xiàn)和提取上，如何從微量接觸檢材中提取到足夠量的DNA，得出完整的STR基因分型圖譜，以滿足法醫(yī)檢驗需要，為偵查破案指明方向，已成為每一個DNA技術工作者研究的課題。硅珠法是提取和純化DNA的常用方法之一，適用于各類生物檢材，尤其適用于腐敗、污穢等檢材，具有經濟、簡便、快速等優(yōu)點。但由于常規(guī)硅珠法實驗操作復雜，實驗過程中模板DNA量損失較大，對微量檢材的檢驗效果欠佳。本文通過對硅珠法進行了改良，與常規(guī)硅珠法進行比較，得出不同的檢測圖譜，驗證了采用改良硅珠法更易得到完整的STR基因分型圖譜，為硅珠法的改進提供強有力的證實。

一、案情簡介

2017年11月13日，安徽省天長市銅城鎮(zhèn)龍崗社區(qū)聯(lián)盟隊丁某福家被人剪鎖入室，被盜三十五只老母雞。接警后，DNA實驗人員與現(xiàn)勘人員同步到達現(xiàn)場，對現(xiàn)場進行研判，被盜現(xiàn)場為簡易搭建的牲畜棚，但由于近期陰雨連連，加之嫌疑人反偵查意識強，中心現(xiàn)場條件十分有限，技術人員立即向外勘查，在外圍現(xiàn)場的墻角處提取一份微濕布條送檢。該檢材被雨水淋濕，DNA含量較低，檢驗難度較大，對檢驗人員是極大的考驗。檢驗人員考慮到各種因素，采用了改良硅珠與常規(guī)硅珠法提取，最終檢出一完整男性STR基因分型圖譜，成功比中盜竊前科人員王某某，從而破獲系列盜竊家禽案。

二、檢材與方法

（一）DNA 提取

生物樣本的采集：用剪刀直接將潮濕布條褶皺較多處剪碎，分成均等的兩份，一份置于1號離心套管采用改良硅珠法提取DNA，一份置于2號離心管采用常規(guī)硅珠法進行處理。

（1）改良硅珠法：采用D-盾超敏DNA提取試劑盒（上?；菸纳锛夹g有限公司）。在1號離心套管中加入裂解液 180ul，99oC裂解 10min，16000r/min離心2min，棄套管后在離心液中加入1000ul吸附液（12gGuSCN 溶于 10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)，加入 0.8ml 0.5mol/L EDTA 和 0.5ml TritomX-100），硅珠 20ul，渦旋后靜置 15min，8000r/min 離心 1min，棄上清，加入400ul漂洗液 （12g GuSCN溶于10ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH6.4)），充分混勻后8000r/min離心1min，棄上清；重復漂洗一次；56oC金屬浴烘干沉淀物，加入20ul洗脫液，充分混勻后56oC金屬浴15min；16000r/min離心2min，取上清進行PCR。[1]

（2）常規(guī)硅珠法：在2號離心管中加入緩沖消化體系（TES100ul，SLS20ul，PK5ul）。震蕩，水浴 3h，將水浴后的離心管，加入三倍的吸附液（375ul），震蕩，12000r/min離心2min，轉移至另一個新的3號離心管中，加入硅珠15ul，靜置15min，將靜置好的3號離心管離心（12000r/min，2min），棄上清，重復一次；加入200ul的70%冷乙醇漂洗1次，棄上清，重復一次；99oC烘干沉淀物，加入15ul純水，充分混勻后56oC金屬浴15min；12000r/min離心2min，取上清進行PCR。[2]

（二）PCR 擴增

擴增在Veriti System （Thermo Fisher公司，美國）上進行。使用ID plus試劑盒，10 ul擴增體系，內含模板 DNA 為 2.0ul，mix4ul，primer2ul，純水 2ul。反應條件為 95oC11min，94oC20s，59oC3min，共 28 個循環(huán)；60oC11min。[3]

（三）電泳分析

PCR擴增產物應用ABI-3500XL型DNA序列分析儀電泳分離和激光掃描分析 （Thermo Fisher公司，美國），采用GeneMapperID-X軟件分析STR基因型。操作步驟按照試劑與儀器說明書進行。

三、結果

按照圖譜峰值在50RFU以上視為檢出、200RFU及以上為可用數(shù)據(jù)，統(tǒng)計采用改良硅珠法和常規(guī)硅珠法所得圖譜峰值在50RFU及以上的基因座。結果顯示：采用常規(guī)硅珠法提取DNA，大片段位點丟失嚴重，未能得到完整STR基因分型圖譜，且峰值高度和平衡性欠佳（如圖1）；采用改良硅珠法提取DNA，可得到16個基因座的完整STR基因分型圖譜，且峰值水平相當，分型準確（如圖2）。驗證采用改良硅珠法提取接觸性DNA更易得到完整的STR基因圖譜。

圖1 微濕布條STR分型圖譜（常規(guī)硅珠法）

圖2 微濕布條STR分型圖譜（改良硅珠法）

四、討論

隨著DNA檢驗技術的普及和發(fā)展，在各級公安機關偵查破案中發(fā)揮著殺手锏的作用，偵查員利用DNA技術破案的意識日益增強，與此同時，犯罪嫌疑人的反偵查意識也逐漸提高，遺留在現(xiàn)場中的生物檢材已由煙蒂、血跡等常規(guī)性檢材轉變?yōu)榇嬖谛问教厥獾姆浅Ｒ?guī)性生物檢材，即接觸性DNA。接觸DNA是指通過皮膚接觸遺留在客體表面的DNA，主要來源于人體皮膚脫落的上皮細胞[4]。采用常規(guī)提取方法難以獲得高質量的DNA模板。本案中的微濕檢材屬于接觸性DNA，微量生物檢材，實際檢驗時，難度較大。

處理接觸性DNA的生物檢材方法很多，如膠帶粘取法[5]、兩步擦拭法、直接剪取法、負壓吸附法[6]、震蕩沖洗法[7]，DNA檢驗技術人員根據(jù)長期積累的經驗，針對不同檢材采取不同方法。每種方法都有其優(yōu)缺點，本論文中采用直接剪取法，操作簡單，易獲得單一基因型，但是會破壞檢材的完整性，將載體置于裂解液中也會影響DNA的質量。

在法醫(yī)DNA物證檢驗中，微濕檢材易受到水的酸堿度、溫度、微生物等未知因素的影響，DNA含量低，易于降解，加之提取和處理環(huán)節(jié)較復雜，不易檢出完整的STR基因分型。有報道稱，適當增加吸附液和硅珠量同時減少洗脫體系可提高硅珠法回收模板DNA的濃度。[8]

硅珠法是提取和純化DNA的常用方法之一，適用于各類案件的檢材，尤其是腐敗、污穢等微量生物檢材，具有經濟、簡便、快速等優(yōu)點。硅珠法是在高濃度硫氰酸胍存在條件下，DNA被二氧化硅特異性地吸附，當條件消失后，被解離下來。由于裂解比較充分，而且硫氰酸胍的存在和漂洗過程可以將雜質及PCR抑制物除去，從而獲得純度高的DNA[9]。硅珠法可在0.5～1ul新鮮血液中提取出足以成功擴增的DNA，提取靈敏度與聚苯乙烯二乙烯基苯樹脂法相當，且不受檢材種類和條件的限制，提取時限短，適用于絕大多數(shù)案件現(xiàn)場檢材的處理。

本實驗中采取改良硅珠法和常規(guī)硅珠法作為對照提取微量生物檢材中DNA，改良硅珠法省去繁瑣的移管步驟，減少漂洗次數(shù)，大大降低了DNA的耗損；同時，適當增加吸附液及硅珠量可保證硅珠與DNA充分結合，小體系洗脫則更易提取到高濃度DNA。常規(guī)硅珠法實驗操作復雜，實驗過程中模板DNA量耗損較大，在DNA提取純化過程中易受移管、試劑劑量、漂洗步驟等因素的影響，在處理微量生物檢材方面效果欠佳[10]。

綜上，本文實驗結果表明，采用改良硅珠法提取和純化樣本DNA，更易得到完整的STR基因分型圖譜。在犯罪現(xiàn)場，一般接觸性檢材DNA來源于脫落細胞，涉及的檢材種類很多，包括各種人體接觸的工具、衣物、電動車把手擦拭物等，DNA含量較少，較難提取。采用改良硅珠法對這些檢材進行檢驗，可以有效地減少DNA的降解，操作方便，穩(wěn)定性較好。