參松養(yǎng)心對心肌梗死家兔心肌微循環(huán)的改善作用及機制研究

饒盼盼 黨松 王晞

[摘要] 目的 探討中成藥參松養(yǎng)心對日本大耳兔心肌梗死模型心肌微循環(huán)的作用及其可能的機制。 方法 采用隨機數(shù)字表法將30只6月齡SPF級日本大耳兔分為Sham組、Control組和MI+SSYX組，每組10只且雌雄各半。Control組和MI+SSYX組通過冠狀動脈左前降支結扎建立心肌梗死模型，Sham組開胸后在冠狀動脈下穿線，但不結扎。術后MI+SSYX組以參松養(yǎng)心0.4 g/（kg·d）溶液灌胃，Sham組和Control組以相同劑量的生理鹽水灌胃。灌胃4周后，將各組日本大耳兔全部處死，在梗死心肌周邊區(qū)取材，采用血管內皮標志物CD34免疫熒光染色法檢測微血管密度，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血漿中內皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2）、一氧化氮（NO）和血管性血友病因子（vWF）的水平。 結果 與Sham組比較，Control組與MI+SSYX組微血管密度明顯降低（P < 0.05）；與Control組比較，MI+SSYX組微血管密度明顯升高（P < 0.05）。與Sham組比較，Control組及MI+SSYX組內皮衍生因子ET-1、NO、TXA2、vWF血漿水平均顯著升高（P < 0.05）；與Control組比較，MI+SSYX組ET-1、TXA2、vWF血漿水平均降低，NO血漿水平升高（P < 0.05）。 結論 參松養(yǎng)心可改善心肌梗死后家兔心肌微循環(huán)，其機制可能與參松養(yǎng)心能夠促進心肌梗死周邊區(qū)毛細血管生成，平衡內皮衍生的血管擴張因子和血管收縮因子的能力相關。

[關鍵詞] 參松養(yǎng)心；心肌梗死；微循環(huán)；內皮衍生因子

[中圖分類號] R259.414 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（a）-0010-04

中藥參松養(yǎng)心是根據(jù)中醫(yī)絡病理論研制的復方制劑，主要由人參、麥冬、桑寄生、山萸肉、丹參、黃連、酸棗仁、五味子、赤芍、土鱉蟲、甘松等組成，有益氣養(yǎng)陰、活血通絡、清心安神的功效[1]。該中藥是臨床上抗心律失常的常用藥，有研究表明參松養(yǎng)心有抗急性心肌缺血損傷的作用[2]，我們的前期研究也表明參松養(yǎng)心對心肌梗死亞急性期的微循環(huán)有改善作用[3]。本研究進一步探究參松養(yǎng)心對心肌梗死家兔心肌微循環(huán)的影響并深入分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康6月齡SPF級日本大耳兔30只，體重2.2～2.7 kg（湖北省生物工程研究所，動物質量合格證號：4200-499472），在武漢大學實驗動物室20～25℃恒溫飼養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法將其分為Sham組、Control組和MI+SSYX組，每組由10只且雌雄各半。術后MI+SSYX組以參松養(yǎng)心原粉（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號：S-131001）0.4 g/（kg·d）溶液灌胃，Sham組和Control組以相同劑量的生理鹽水灌胃。

1.2 動物模型制備

采用冠狀動脈左前降支結扎建立心肌梗死模型。動物稱重后以0.8%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）耳緣靜脈麻醉，固定體位，頸部和胸部備皮。連接實驗用心電監(jiān)護儀，觀察心電圖形態(tài)。酒精消毒，鋪無菌洞巾。調節(jié)呼吸機參數(shù)，行常規(guī)氣管插管。沿胸壁左旁正中開胸，用開胸器撐開切口，剪開心包，充分暴露心臟，尋找并結扎冠狀動脈左前降支。以觀察到結扎以下心肌顏色變暗，搏動幅度減弱，且心電監(jiān)護顯示Ⅰ、Ⅱ、aVL導聯(lián)ST段抬高0.2 mV為手術成功的標準。Sham組開胸后在冠狀動脈左前降支下穿線，但不結扎。關閉并逐層縫合切口。術后各組家兔均接受40萬U青霉素（華北制藥股份有限公司，批號：1204103）肌內注射，連續(xù)3 d，預防感染。

1.3 免疫熒光檢測

治療4周后，將三組家兔全部處死，取梗死心肌周邊組織，用4℃生理鹽水清洗殘留血液后浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h。經(jīng)梯度酒精脫水和石蠟包埋后，將石蠟切片浸入二甲苯脫蠟，梯度酒精中逐漸水化后行抗原修復，然后按照試劑盒（Abcam，批號：ab81289）說明書進行CD34及DAPI免疫熒光雙標。每張切片在光學顯微鏡下放大400倍，隨機選擇5個視野進行CD34染色陽性計數(shù)（凡是染成棕黃色的血管內皮細胞或者內皮細胞簇均作為1個血管計數(shù)，管腔直徑超過2 μm或肌肉層超過3層的血管均不計數(shù)），并取5個區(qū)域的CD34陽性計數(shù)的平均數(shù)作為該切片的微血管密度。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

治療4周后，三組家兔均通過采血針從頸靜脈抽取2 mL血注入真空分離膠促凝管中，靜置10 min后置于離心機中以轉速3000 r/min、離心半徑8 cm離心15 min，收集上清液并放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。然后按照試劑盒（HCB，Canada）說明書進行ELISA試驗，檢測血漿樣本中內皮素1（ET-1）、一氧化氮（NO）、血栓素A2（TXA2）和血管性血友病因子（vWF）水平。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌梗死模型

心肌梗死模型制備過程中，2只新西蘭大耳白兔意外死亡（1只死于心律失常，1只原因不明），剩余28只（Sham組10只、Control組9只、MI+SSYX組9只）均制備心梗模型成功，且順利完成各指標的檢測。模型制備成功的心電圖見圖1。

2.2 三組家兔心肌梗死周邊區(qū)心肌微血管密度比較

與Sham組比較，Control組及MI+SSYX組微血管密度明顯降低（P < 0.05）。與Control組比較，MI+SSYX組微血管密度明顯升高（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.3 三組家兔ET-1、NO、TXA2和vWF血漿水平的比較

與Sham組比較，Control組及MI+SSYX組ET-1、NO、TXA2、vWF血漿水平均顯著升高（P < 0.05）。與Control組比較，MI+SSYX組ET-1、TXA2和vWF血漿水平均降低（P < 0.05），NO血漿水平升高（P < 0.05）。見圖3。

3 討論

本研究探究參松養(yǎng)心對心肌梗死的日本大耳兔心肌微循環(huán)的作用及其可能的機制。結果顯示，參松養(yǎng)心可以增加梗死心肌周邊區(qū)域的微血管密度，降低血漿中內皮衍生子TXA2、ET-1、vWF水平，升高NO水平，即平衡內皮衍生的血管擴張因子和血管收縮因子，從而改善心肌梗死后梗死周邊組織心肌微循環(huán)。

中醫(yī)認為急性心肌梗死為本虛標實之證，本虛包括氣、血、陰、陽不足，以氣虛、陽虛為主，標實包括寒凝、氣滯、血瘀、痰濁，以血瘀、痰濁為主[4]。參松養(yǎng)心是基于中醫(yī)絡病學理論研制而成的具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡功效的中成藥。方中人參有大補元氣、復脈固脫、生津安神等功效[5]。對于心血管系統(tǒng)，研究顯示人參能夠保護血管內皮細胞、抗心律失常、降壓、抑制心室重構、改善高脂血癥、抗心源性休克等[6]。麥冬為常用的養(yǎng)陰中藥，藥理實驗表明麥冬有很好的抗血栓作用，能增加心肌收縮力和冠脈流量，保護血管內皮細胞[7]。丹參為臨床上常用的活血化瘀藥物，有抗氧化、抗血小板聚集、保護血管內皮、改善微循環(huán)等藥理作用[8-9]。桑寄生有補肝腎、益精血、祛風濕、通經(jīng)絡、養(yǎng)血脈、安胎元的作用。且有臨床研究表明，桑寄生對心律失常、心痛、短氣均有療效[10-11]。山茱萸能改善血管內皮損傷，且與調節(jié)血管活性物質ET/NO、TXA2/PGI2穩(wěn)態(tài)有關[12]。根據(jù)熱毒傷絡的假說，黃連作為清熱解毒的代表藥，對梗死心肌血液循環(huán)也有改善作用[13-14]。酸棗仁能鎮(zhèn)靜催眠、保護心肌細胞、抗動脈粥樣硬化、降血壓、降血脂、改善血液流變學以及加強學習記憶能力等[15]。土鱉蟲是傳統(tǒng)的活血化瘀藥，中醫(yī)臨床上用于治療冠心病、高血壓，具有抗凝血、抗缺氧、調血脂、抗突變、保護血管內皮細胞等作用[16]。甘松具有鎮(zhèn)靜降壓，抗心律失常、潰瘍、細胞毒活性、瘧疾的作用[17]。從藥方各組分藥理作用來看，參松養(yǎng)心為改善心肌梗死血液循環(huán)的對癥藥。

有研究表明，微血管功能障礙是決定急性心肌梗死（AMI）患者3個月后左室射血分數(shù)（LVEF）和左室重塑程度的重要因素[18]。冠脈閉塞導致細胞壞死，引起毛細血管等微血管損傷及心肌再灌注損傷，最終引起水腫和微血管內皮功能障礙，導致大約40%的AMI患者成功再灌注治療后出現(xiàn)心肌“無復流”現(xiàn)象（no-reflow phenomenon）[19-20]。因此，改善AMI患者的微血管功能是必要的治療措施。但目前AMI管理主要強調及時開放心臟表面的梗阻冠脈，治療主要集中在及時開通大血管上，重建走行于心肌內的微血管血供并未得到臨床治療重視。血管內皮細胞調節(jié)冠狀動脈血流量主要通過釋放血管活性因子，其中NO是一種主要的內皮細胞衍生的擴血管因子[21-22]，ET-1是一種內源性的血管活性肽，對冠狀動脈發(fā)揮穩(wěn)定而持久的血管收縮作用，是最有效的血管收縮劑之一[23]。TXA2具有很強的促血小板聚集作用，是增加心肌梗死患者發(fā)病率和死亡率重要的風險因子之一[24-25]。生理狀態(tài)下，內皮細胞合成vWF，調節(jié)內皮細胞黏附于血管壁；病理狀態(tài)下，活化的血小板釋放vWF介導血管損傷部位的血小板聚集和黏附于膠原，促進血栓形成[26-27]。參松養(yǎng)心能有效調節(jié)這兩類內皮衍生因子，改善心臟微循環(huán)。

綜上所述，參松養(yǎng)心藥方的配伍原理及各成分的藥理作用與本研究的實驗結果相互支持，可以認為參松養(yǎng)心能夠通過重建和維持AMI后心肌微血管灌注，起到保護心肌的作用。但有待進一步研究以明確作用機制，如所涉及微循環(huán)保護的具體信號通路等。

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（收稿日期：2018-06-11 本文編輯：羅喬荔）