CSFV的反向遺傳系統(tǒng)

趙妍

【摘 要】對(duì)于家豬和野豬來(lái)說(shuō)，豬瘟是一種具有極高傳染力及高致死率的烈性傳染病。豬瘟是由豬瘟病毒（Classic Swine Fever Virus， CSFV）引起的病毒性傳染病，CSFV屬于黃病毒科，瘟病毒屬，是一種單股正義RNA病毒。在CSFV的研究當(dāng)中，反向遺傳學(xué)應(yīng)用十分廣泛，論文主要介紹幾種比較成熟的CSFV反向遺傳系統(tǒng)。近年來(lái)，反向遺傳學(xué)在CSFV的研究方面得到不斷發(fā)展，論文就CSFV的幾種反向遺傳系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以期為CSFV的研究及防控提供參考。

【關(guān)鍵詞】CSFV;豬瘟;反向遺傳學(xué)

【Keywords】CSFV; classical swine fever; reverse genetics

【中圖分類號(hào)】S852.65? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文章編號(hào)】1673-1069（2018）12-0182-02

1 引言

反向遺傳學(xué)是利用病毒的全長(zhǎng)基因組來(lái)產(chǎn)生完整病毒的方法，是現(xiàn)在病毒學(xué)研究中最強(qiáng)有力的工具。反向遺傳學(xué)通常用于研究病毒復(fù)制、感染、蛋白功能、病毒與宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1]。近年來(lái)，反向遺傳學(xué)在CSFV的研究方面得到不斷發(fā)展，本文就CSFV的幾種反向遺傳系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以期為CSFV的研究及防控提供參考。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年因豬瘟造成的經(jīng)濟(jì)損失已超過(guò)100億元。豬瘟嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并對(duì)食品安全造成威脅。因此，對(duì)該病進(jìn)行全面、綜合防控，具有必要的現(xiàn)實(shí)意義。本文對(duì)CSFV及功能相關(guān)基因、蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行介紹，為全面了解CSFV、全方位防控豬瘟提供理論支持。

2 CSFV的幾種反向遺傳系統(tǒng)

2.1 T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)錄反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

T7 RNA聚合酶，是一種高度特異識(shí)別T7啟動(dòng)子序列的DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化單鏈或雙鏈DNA T7啟動(dòng)子下游NTP的摻入，合成與T7啟動(dòng)子下游的模板DNA互補(bǔ)的RNA[2]。

Meyers（Meyers et al.， 1996）首先對(duì)CSFV 5到3進(jìn)行了全基因組鑒定，將CSFV全基因組克隆到低拷貝質(zhì)粒中，并在基因組3端加入T7啟動(dòng)子，利用Srf I將質(zhì)粒線性化后，在T7 RNA聚合酶作用下體外轉(zhuǎn)錄得到RNA，并轉(zhuǎn)染進(jìn)SK6細(xì)胞系中拯救病毒，這一方法在現(xiàn)在的CSFV研究中依然應(yīng)用十分廣泛。Fan（Fan et al.， 2009）將上述方法進(jìn)行了改進(jìn)，將由T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的vRNA轉(zhuǎn)染到BHK21細(xì)胞系中，培養(yǎng)一段時(shí)間后，將含有病毒的上清感染PK15細(xì)胞，用此方法得到的CSFV病毒滴度是之前的8倍左右。

2.2 T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

Gennip（Gennip et al.， 1999）建立了一種更方便、高效的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反向遺傳系統(tǒng)。首先他建立了可以穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的SK6細(xì)胞系SK6-T7 RNA pol，將線性化的CSFV cDNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，轉(zhuǎn)錄過(guò)程在細(xì)胞中完成并得到病毒RNA，產(chǎn)生CSFV病毒，該方法大大提高了病毒滴度，其滴度約為體外轉(zhuǎn)錄的200倍[3]。Bergeron（Bergeron， 2002）通過(guò)在CSFV 3端插入了HDV核酶及T7終止子，構(gòu)建了一種新型的基于T7 RNA聚合酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，該系統(tǒng)不需要Srf I就能在CSFV末端形成精確的3NCR，節(jié)約了構(gòu)建成本。

2.3 II型RNA聚合酶介導(dǎo)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

Li（Li et al.， 2013）在CSFV 5NCR加入CMV啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子和HamRZ，在3NCR加入HdvRZ，T7終止子和SV40 polyA，HamRZ與HdvRZ可以生成正確的5NCR及 3NCR，且能在T7 RNA聚合酶或者II型RNA聚合酶的作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，該方法拯救的病毒滴度是體外轉(zhuǎn)錄的120倍。

2.4 I型RNA聚合酶介導(dǎo)的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)

本實(shí)驗(yàn)室在上述基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一種新的依賴pol Ⅰ拯救病毒的CSFV cDNA克隆，我們?cè)赑K15細(xì)胞基因組中擴(kuò)增得到豬的啟動(dòng)子，并參照文獻(xiàn)合成在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有極高終止效率的鼠終止子，分別插入CSFV 5NCR之前和3NCR之后。該系統(tǒng)能直接將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，拯救出CSFV病毒，這種基于pol Ⅰ啟動(dòng)子的反向遺傳操作系統(tǒng)能產(chǎn)生具有精確末端基因組的CSFV，且具有更高的拯救效率，為后續(xù)修飾性減毒活疫苗和標(biāo)記疫苗的研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 帶有標(biāo)記的CSFV反向遺傳系統(tǒng)

基于傳統(tǒng)的反向遺傳系統(tǒng)，具有標(biāo)記或定量功能的CSFV cDNA克隆被設(shè)計(jì)出來(lái)，如在Li實(shí)驗(yàn)組建立了一種簡(jiǎn)化的中和抗體試驗(yàn)，用于檢測(cè)CSFV，首先在Npro后插入了EGFP基因，在病毒產(chǎn)生的同時(shí)合成EGFP，從而省去熒光染色，達(dá)到檢測(cè)病毒的目的[4]。本實(shí)驗(yàn)室在1.4中的反向遺傳系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，在Npro后面加入了Rluc基因，得到了可以用于定量實(shí)驗(yàn)的CSFV反向遺傳系統(tǒng)，即可以通過(guò)收集Rluc氧化過(guò)程中釋放的生物熒光，定量地檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因的相互作用。

帶有標(biāo)記的CSFV反向遺傳系統(tǒng)在傳統(tǒng)的反向遺傳系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，在達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡耐瑫r(shí)，使反應(yīng)更加快速，簡(jiǎn)便，增加了方法的實(shí)用性，為后續(xù)開展修飾性減毒活疫苗和標(biāo)記疫苗的研發(fā)做了很好的鋪墊。

4 展望

反向遺傳操作系統(tǒng)為RNA 病毒研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的平臺(tái)，能夠恢復(fù)具有全長(zhǎng)病毒基因組的病毒[5]。利用這個(gè)平臺(tái)，人們可以通過(guò)基因重組、基因突變等 手段來(lái)研究病毒的復(fù)制、感染，病毒蛋白的功能、病毒與宿主細(xì)胞之間的關(guān)系。抗病毒策略和標(biāo)記疫苗的發(fā)展也離不開反向遺傳操作，如找出與毒力相關(guān)性基因，對(duì)其進(jìn)行缺失或修飾處理，從而得到新的無(wú)毒或減毒毒株，以此制備新型的減毒活疫苗，同時(shí)可以制備嵌合抗體，開發(fā)多價(jià)疫苗[6]。反向遺傳系統(tǒng)作為動(dòng)物病毒的研究方法，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫苗、CSFV毒力機(jī)制及蛋白功能研究中，極大地推動(dòng)了動(dòng)物病毒的研究發(fā)展，為疾病的研究及防控起著重要作用。

【參考文獻(xiàn)】

【1】Bergeron， L.J. Development and comparison of procedures for the selection of delta ribozyme cleavage sites within the hepatitis B virus[J]. Nucleic Acids Research， 2002（30）： 4682-4691.

【2】Fan， Y.F.， Zhao， Q.Z.， Zhao， Y.， etc. Recovery of the Infectious Classical Swine Fever Virus from the Cloned cDNA of Low Temperature Attenuated Thiverval Strain[J]. Chinese Journal of Animal & Veterinary Sciences，2009（40）， 1420-1425.

【3】Gennip， H.G.P.v.， Rijn， P.A.v.， Widjojoatmodjo， M.N.， etc.Recovery of infectious classical swine fever virus （CSFV） from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 RNA polymerase[J]. Journal of Virological Methods， 1999（78）： 117.

【4】Li， C.， Huang， J.， Li， Y.， etc. Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system[J]. Archives of Virology ，2013（158）： 901-907.

【5】Meyers， G.， Thiel， H.J.， Rümenapf， T . Classical swine fever virus： recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles[J]. Journal of Virology，1996（70）： 1588-1595.

【6】WU C W， CHIEN M S， HUANG C. Characterization of the swine U6 promoter for short hairpin RNA expression and its application to inhibition of virus replication[J]. J Biotechnol， 2013，168（1）：78-84.