食管鱗狀細胞癌HPV 16/18型感染與p53表達的相關性研究

詹泳杰 吳騰飛 茅乃權(quán)

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，不同地區(qū)其發(fā)病率及病理類型存在明顯差異［1］。國家癌癥中心研究報告顯示，我國食管癌的發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤第6位和第4位［2］。研究發(fā)現(xiàn)食管癌發(fā)病可能與生活環(huán)境、飲食習慣、病毒感染、遺傳易感性等因素有關［3-4］。Syrjanen等［5］于 1982年首先提出人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染與食管癌有關，隨后亦有諸多相關報道［6-7］，但HPV感染與食管癌的關系仍存在爭議。p53作為與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因，其產(chǎn)物對基因修復與染色體穩(wěn)定有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，30%～70%食管癌患者存在p53基因突變［8-9］。食管鱗狀細胞癌的發(fā)生是否與HPV感染和p53基因突變有關尚未明確。本研究旨在闡明HPV l6/18感染與食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的關系，并探討其與p53表達的相關性，為食管鱗狀細胞癌的早期預防、診斷及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2009年1月至2012年12月于廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院診治的食管鱗狀細胞癌患者術(shù)后病理組織蠟塊標本56例（鱗癌組），并以同期24名健康者正常食管活檢組織蠟塊標本作為對照組。所有患者均經(jīng)病理檢查確診為食管鱗狀細胞癌，術(shù)前均未接受放療、化療等抗腫瘤治療，且具有完整的臨床和病理資料。鱗癌組患者男性46例，女性10例；年齡37～75歲，平均（55.7±9.7）歲；參照國際抗癌聯(lián)盟（union for international cancer control，UICC）2018 年實施的第 8版食管癌TNM分期系統(tǒng)進行臨床分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期13例，Ⅲ期37例，Ⅳ期3例；腫瘤分化程度：高度分化3例，中度分化23例，低度分化30例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要儀器和試劑

TIANamp FFPE DNA Kit DP331試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，2×Taq MasterMix（含染料）購自北京康為世紀生物科技有限公司，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。鼠抗人p53單克隆抗體（D0-7）、即用型SP免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 實時熒光定量PCR檢測HPV 16/18 E6、E7基因的表達

所有標本均經(jīng)常規(guī)福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)5 μm切片。取石蠟切片（厚5～10 μm，大小1 cm×1 cm）5～8張，使用 TIANamp FFPE DNA Kit DP331試劑盒提取組織基因組DNA，置于-20℃冰箱保存。用分光光度計檢測DNA的濃度及純度。

HPV16/18 E6、E7基因采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增檢測，反應體系為 2×Taq MasterMix 12.5 μL，dNTPs 3 μL，上下游引物各 1 μL，Rnase-Free Water 7.5 μL，DNA 模板 3 μL。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸5 min，共40個循環(huán)。反應產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)照相鑒定。PCR引物設計見表1。

表1PCR引物信息

1.4 免疫組化SP法檢測p53蛋白的表達水平

實驗以PBS液取代一抗作陰性對照，嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木素復染，梯度脫水，透明后封片鏡檢。以細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性。在高倍鏡下（×400）對每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算其百分比。陽性細胞數(shù)＜5%為陰性（-），5%～25%為弱陽性（+），26%～50%為中度陽性（++），＞50%為強陽性（+++），（+）、（++）、（+++）均為陽性表達。

1.5 隨訪情況

本研究納入的56例患者每6個月定期隨訪1次，隨訪方式為患者門診復查、電話隨訪、上門隨訪及詢問親屬等，隨訪終點為患者發(fā)生死亡事件或隨訪時間已滿5年，隨訪截至2017年12月31日。隨訪期間死亡45例，存活11例?？偵鏁r間（overall survival，OS）定義為患者接受手術(shù)之日至死亡或隨訪結(jié)束的時間。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；HPV感染與p53之間的關系采用Spearman相關分析；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗；采用Cox回歸分析HPV感染和p53表達與患者OS的關系，其中模型1為單因素Cox回歸，模型2為多因素Cox回歸，調(diào)整年齡、性別、病理分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等潛在混雜因素。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV16/18在不同食管組織中的感染情況

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖1），在408 bp、142 bp、313 bp和193 bp處出現(xiàn)擴增帶，分別為 HPV16 E6、HPV16 E7、HPV18 E6 和 HPV18 E7陽性，出現(xiàn)以上1項陽性指標則判斷為HPV感染陽性。鱗癌組和對照組HPV感染率分別為44.6%（25/56）和12.5%（3/24），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.630，P=0.006）。

2.2 p53蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達

免疫組化實驗結(jié)果顯示，p53陽性信號位于細胞核內(nèi)，呈棕褐色，見圖2。鱗癌組和對照組p53蛋白陽性表達率分別為 41.1%（23/56）和 4.2%（1/24），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.896，P＜0.001）。

圖1 HPV16/18 E6、E7基因PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖2 p53蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的表達（SP×400）

2.3 HPV16/18感染與食管鱗狀細胞癌患者臨床病理特征的關系

56例食管鱗狀細胞癌患者中，HPV感染與患者的性別、年齡無關（P＞0.05），與病理分級、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關（P＜0.05）。HPV感染與p53蛋白表達有關（χ2=17.849，P＜0.001），進一步的 Spearman 相關分析結(jié)果顯示，兩者呈正相關（r=0.565，P＜0.001）。見表2。

2.4 HPV感染及p53表達與食管鱗狀細胞癌患者預后的關系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，HPV感染陽性、p53表達陽性患者中位OS均小于HPV感染陰性、p53表達陰性者（21個月vs39個月，χ2=4.306，P=0.038；17 個月vs41 個月，χ2=5.868，P=0.015），見圖 3。調(diào)整年齡、性別、病理分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等潛在的混雜因素后，HPV 感染（HR=1.834，95%CI：1.010～3.330，P=0.046） 和 p53 陽性表達（HR=2.189，95%CI：1.182～4.054，P=0.013）均可增加食管鱗狀細胞癌患者的死亡風險，見表3。

表3 HPV感染和p53蛋白表達與食管鱗狀細胞癌預后的關系

3 討論

食管癌為原發(fā)于食管黏膜上皮組織的惡性腫瘤，其中鱗狀細胞癌最常見，約占食管癌病變類型的95%［3］。近年我國食管癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且患者日益年輕化，探索食管鱗狀細胞癌的發(fā)病機制，將有助于食管癌的篩查、早期診斷和治療。

HPV是一類體積微小且無包膜的DNA病毒，HPV DNA常游離于染色體之外，而在惡性腫瘤內(nèi)，HPV DNA整合到宿主細胞DNA中，導致HPV E2基因失去對HPV E6、HPV E7基因啟動的負性調(diào)節(jié)，使E6、E7基因表達異常，導致細胞惡性增殖［10］。體外實驗研究［11］發(fā)現(xiàn)，高危型HPV16/18 E6、E7基因能誘導食管上皮細胞使其惡性轉(zhuǎn)化，提示HPV感染可能是食管癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細胞癌組織HPV感染率為44.6%，明顯高于正常組織，且患者的臨床分期、病理分級越高或有淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移HPV的感染率越高，提示HPV16/18型感染與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展可能有關，進一步檢測食管癌患者HPV感染情況，或可輔助早期診斷。

在HPV DNA復制過程中E6、E7基因有至關重要的作用，其編碼的癌蛋白可與體內(nèi)多種內(nèi)源性蛋白結(jié)合，目前報道p53蛋白最多。p53基因是重要的抑癌基因，大多腫瘤的發(fā)生與p53基因突變有關［12］。本研究結(jié)果顯示，p53蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率為41.1%，明顯高于正常組織，且與HPV感染呈正相關，提示兩者之間可能存在調(diào)控關系，共同促進食管鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展?？赡茉蚴鞘彻荀[狀細胞癌中p53基因突變或p53蛋白與HPV16/18基因產(chǎn)物結(jié)合，導致p53蛋白正常功能喪失，從而產(chǎn)生促癌作用，因此深入研究HPV感染對p53的調(diào)控機制及其對細胞轉(zhuǎn)化的影響，可能有助于進一步揭示食管磷狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的機制。本研究進一步分析HPV感染、p53蛋白表達情況與食管鱗狀細胞癌患者預后的關系，發(fā)現(xiàn)HPV感染者及p53陽性表達者生存期均顯著縮短，與相關文獻［13-14］的研究結(jié)果一致。控制年齡、性別、病理分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等潛在的混雜因素后，多因素Cox回歸分析顯示HPV感染及p53表達是影響食管鱗狀細胞癌患者總生存的危險因素，提示HPV感染及p53陽性表達的食管鱗狀細胞癌患者預后較差，可能是判斷預后的潛在指標。

綜上所述，HPV感染和p53蛋白陽性表達可能共同參與食管鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展，同時可增加食管鱗狀細胞癌患者的死亡風險。因此，檢測HPV感染及p53表達情況，對食管鱗狀細胞癌的早期預防、診斷及治療有一定意義。但本研究樣本量較少，相關結(jié)論仍需進一步證實，后期可考慮加大樣本量再次進行分析。