白藜蘆醇對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響

張?jiān)普?邵松軍余紅 袁國(guó)航方海燕

肺癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)在我國(guó)均居首位，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell carcinoma，NSCLC）占75%～85%［1-2］。自噬是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的主要途徑之一，其通過(guò)自噬-溶酶體途徑將受損蛋白質(zhì)及老化的細(xì)胞器等運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝需要和某些細(xì)胞器更新。研究發(fā)現(xiàn)在人胃癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞中，自噬可抑制細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞凋亡［3-5］。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種從花生、葡萄等植物中提取的天然多酚類化合物，具有抗纖維化、抗腫瘤和抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用［6-7］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞［8］和乳腺癌細(xì)胞［9］中，白藜蘆醇可通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬而發(fā)揮殺傷作用。但白藜蘆醇對(duì)NSCLC細(xì)胞自噬和凋亡的影響少見(jiàn)報(bào)道。本研究采用白藜蘆醇作用NSCLC A549細(xì)胞，并觀察其對(duì)自噬水平和細(xì)胞凋亡的影響，以期為NSCLC的治療提供新的依據(jù)和靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

白藜蘆醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DAPI溶液、RIPA強(qiáng)裂解液均購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，蛋白酶抑制劑混合物購(gòu)自上?？党缮镉邢薰?，雙抗（青霉素、鏈霉素）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，BCA蛋白含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，自噬雙標(biāo)腺病毒（mRFP-GFP-LC3）購(gòu)自上海漢恒生物技術(shù)有限公司，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，caspase-3、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62等抗體均購(gòu)自美國(guó) CST 公司，Bax、Bcl-2、Beclin1、GAPDH 等抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均購(gòu)自武漢普瑞美斯生物有限公司，熒光二抗羊抗兔購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

NSCLC細(xì)胞株A549細(xì)胞購(gòu)自廣州吉尼歐生物科技有限公司。將A549細(xì)胞復(fù)蘇后接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，加入含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化液消化，每2～3 d傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將A549細(xì)胞按5×105/孔接種于6孔板中，加入含10%FBS的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第2天更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基靜止24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，將細(xì)胞分為對(duì)照組和Res組，對(duì)照組用2%FBS的DMEM培養(yǎng)，Res組用2%FBS+50 μmol/L白藜蘆醇的DMEM培養(yǎng)。

1.3 倒置顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)

將細(xì)胞接種在6孔板中，白藜蘆醇處理24 h后在倒置顯微鏡下觀察兩組細(xì)胞的形態(tài)。

1.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察A549細(xì)胞自噬體的形成

細(xì)胞爬片后，待A549細(xì)胞生長(zhǎng)融合至50%～60%，用mRFP-GFP-LC3病毒感染24 h后加雷帕霉素誘導(dǎo)12 h，再用白藜蘆醇預(yù)處理24 h，然后用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察兩組細(xì)胞自噬體的形成。

1.5 Westernblot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、活化caspase-3的表達(dá)

將10 cm2培養(yǎng)皿中的對(duì)照組和Res組細(xì)胞用PBS洗3遍，用RIPA強(qiáng)裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF提取細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒測(cè)定總濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗 Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、活化 caspase-3（1∶1 000）、Beclin1（1∶1 000），LC3 Ⅱ/Ⅰ（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4℃孵育過(guò)夜，室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶6 000）、羊抗小鼠 IgG（1∶6 000），ECL 發(fā)光液曝光，用Image Lab軟件分析。以目的蛋白條帶的灰度值和內(nèi)參GAPDH的蛋白條帶灰度值的比值確定目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后的形態(tài)

A549細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈不規(guī)則形，細(xì)胞之間緊密連接，貼壁生長(zhǎng)良好；Res組鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞形狀開(kāi)始變圓，排列稀疏，細(xì)胞之間連接較松散，貼壁細(xì)胞較對(duì)照組減少，見(jiàn)圖1。

圖1 倒置顯微鏡下觀察A549細(xì)胞的形態(tài)（×200）

2.2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察A549細(xì)胞自噬體的形成

白藜蘆醇干預(yù)24 h后，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到Res組A549細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)大量自噬體形成（點(diǎn)狀聚集），而對(duì)照組則無(wú)明顯的自噬體形成，見(jiàn)圖2。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察A549細(xì)胞自噬體的形成（×400）

2.3 A549細(xì)胞中自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

白藜蘆醇干預(yù)24 h后提取蛋白，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Res組A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白 Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)升高（0.151±0.032vs0.093±0.013，P=0.011；3.644±0.122vs1.903±0.054，P＜0.001），p62 蛋白表達(dá)下降（0.032±0.002vs0.061±0.005，P=0.021），見(jiàn)圖 3A。與對(duì)照組比較，Res組A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、活化caspase-3表達(dá)升高（0.633±0.061vs0.423±0.053，P=0.011；0.154±0.004vs0.111±0.011，P=0.002），Bcl-2 蛋白表達(dá)下降（2.437±0.055vs3.503±0.138，P＜0.001），見(jiàn)圖 3B。

3 討論

白藜蘆醇是一種多酚類化合物，近年較多研究報(bào)道了白藜蘆醇的抗腫瘤作用［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制軟骨肉瘤細(xì)胞增殖［11］；而白藜蘆醇類似物3，4，4′-THS可通過(guò)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞發(fā)生凋亡［12］。Fang等［13］研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可通過(guò)STAT-3信號(hào)通路抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。在胃癌細(xì)胞中，白藜蘆醇能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)并激活NF-κB，從而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［14］，以上研究提示白藜蘆醇可能通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞自噬從而誘導(dǎo)其凋亡。本研究采用白藜蘆醇干預(yù)NSCLC A549細(xì)胞24 h后，觀察到細(xì)胞形狀較正常變圓，細(xì)胞排列較稀疏，提示細(xì)胞可能開(kāi)始發(fā)生凋亡。Western blot進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)Res組中促凋亡蛋白Bax和線粒體凋亡蛋白活化caspase-3表達(dá)增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量減少，提示白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后其細(xì)胞凋亡水平上升。分析原因可能是外界應(yīng)激作用于線粒體細(xì)胞通路后，細(xì)胞色素C等小分子得到釋放，從而下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax，繼而使活化caspase家族出現(xiàn)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12，15］。

圖3 不同處理組A549細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和凋亡蛋白的表達(dá)

自噬是細(xì)胞受到外界刺激下的自我保護(hù)機(jī)制，研究表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤和人中性粒細(xì)胞中，自噬可加速細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖［16-17］，其機(jī)制可能是自噬可清除受損線粒體，使細(xì)胞色素C水平減少，從而抑制線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇干預(yù)可促使A549細(xì)胞凋亡，為探究這一現(xiàn)象是否通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度自噬而發(fā)揮作用，本研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體的形成情況，Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白 Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)A549細(xì)胞后，自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)增加，但自噬消化底物p62的表達(dá)量有所下降，原因可能是自噬上游表達(dá)增強(qiáng)或者下游降解阻斷，都會(huì)導(dǎo)致p62的聚集，最終p62納入成熟的自噬體內(nèi)，并在自噬體內(nèi)降解，從而激活細(xì)胞過(guò)度自噬。綠色熒光蛋白GFP對(duì)酸性較敏感，當(dāng)溶酶體與自噬小體融合形成自噬溶酶體時(shí)，GFP變?nèi)酰虼酥荒軝z測(cè)到紅色熒光，而紅色熒光即指示自噬溶酶體。本研究用mRFP-GFP-LC3病毒感染，在激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到Res組細(xì)胞胞漿內(nèi)大量自噬小體形成，說(shuō)明白藜蘆醇干預(yù)后，A549細(xì)胞的“自噬流”水平有所上升，細(xì)胞自噬顯著增加，再次印證Western blot檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)凋亡蛋白表達(dá)增加，提示白藜蘆醇可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞過(guò)度自噬從而導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的，有望為肺癌的臨床防治提供新的靶點(diǎn)和思路。但是二者相互作用的具體機(jī)制仍未知，后續(xù)將聯(lián)合應(yīng)用自噬促進(jìn)劑或抑制劑從細(xì)胞和動(dòng)物兩方面進(jìn)行研究，并探討經(jīng)典PI3K/Akt信號(hào)通路和線粒體途徑，進(jìn)一步深入研究自噬和凋亡的機(jī)制。