巖黃連水提物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和遷移能力的影響及其可能機(jī)制

鞠佳霓 明志勇 代全楷 李科志 黃山 何劍波 鄔國(guó)斌 陳闖

原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康［1］。肝癌治療強(qiáng)調(diào)多學(xué)科協(xié)作［2］，其中中醫(yī)藥可以緩解肝癌患者癥狀，穩(wěn)定瘤體，提高生存質(zhì)量［3］。巖黃連是一種“壯藥”，為罌粟科多年生草本植物，主要分布于廣西和貴州等石山地區(qū)，性涼，味苦，歸肝經(jīng)，具有清熱解毒、利濕、止痛止血、抗菌、消炎及抗腫瘤作用［4］，但巖黃連抗肝癌的作用機(jī)制尚未十分明確。本研究將巖黃連水提物與肝癌HepG2細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察其對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探討可能的作用機(jī)制，為肝癌治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝癌細(xì)胞株HepG2由廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司，活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK8）購(gòu)自同仁化學(xué)研究所，Transwell小室購(gòu)自Corning公司，TRIzol購(gòu)自Ambion公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，免疫印跡試驗(yàn)設(shè)備購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，NF-κBp65抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，巖黃連購(gòu)自南寧市景昌中藥飲片有限公司。取200 g巖黃連，加入500 mL超凈水，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎60 min，濾布濾過(guò)，藥渣以300 mL水煎30 min，合并2次藥液，離心后過(guò)濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至350 mL，最后用凍干機(jī)制成凍干粉劑23.4 g（8.54 g生藥量/1 g凍干粉），取一定量制備好的凍干粉，用DMEM培養(yǎng)基配置成濃度為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的含藥培養(yǎng)基各100 mL，37℃水浴鍋溶解離心后用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)、傳代。以含不同濃度巖黃連水提物（0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL）培養(yǎng)基100 mL分別作用于肝癌HepG2細(xì)胞，以等量未處理培養(yǎng)基培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞為對(duì)照組。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝癌HepG2細(xì)胞，0.05%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌3次，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔約3 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)分別加入 CCK-8 溶液 10 μL/孔，置于 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔吸光值。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算公式為細(xì)胞增殖抑制率=［1-（巖黃連水提物組吸光值/對(duì)照組吸光值）］×100%。

1.2.3 Transwell法檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞的遷移能力

在下室加入600 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)基，上室加入100 μL經(jīng)上述處理48 h的肝癌HepG2細(xì)胞懸液，約5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。用鑷子取出小室，吸出上室液體，用濕棉簽拭去微孔膜上層細(xì)胞，甲醇固定30 min，吉姆薩染色50 min，清洗2次后于顯微鏡下觀察，每個(gè)小室至少計(jì)數(shù)5個(gè)視野，每組2個(gè)平行孔，計(jì)算各組小室透過(guò)基底細(xì)胞膜的平均細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)NF-κBp65 mRNA的表達(dá)水平

收集經(jīng)上述處理48 h的肝癌HepG2細(xì)胞懸液，加入1 mL TRIzol，按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR以SYBR Green染料為熒光檢測(cè)信號(hào)，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明，每組的Real-time PCR體系為20 μL。各組每個(gè)基因均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。GAPDH作為內(nèi)參，RT-qPCR引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火并延伸30 s，共42個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量?！鳌鰿t值=［巖黃連水提物組靶基因Ct值-巖黃連水提物組GAPDH Ct值］-［對(duì)照組靶基因Ct值-對(duì)照組GAPDH Ct值］，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1RT-qPCR引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè)NF-κBp65蛋白表達(dá)水平 收集經(jīng)上述處理48 h的肝癌HepG2細(xì)胞懸液，提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸蛋白分析法測(cè)定蛋白濃度。各孔加入30 μg蛋白樣品，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。4℃孵育NF-κBp65抗體過(guò)夜。次日室溫孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光法顯影曝光，圖片經(jīng)Image lab軟件分析灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巖黃連水提物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.4 mg/mL巖黃連水提物作用24 h、48 h和72 h，肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.925，P＜0.001），且 48 h的細(xì)胞增殖抑制率高于24 h（P＜0.01），72 h時(shí)則表現(xiàn)為促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)（P＜0.01）。0.8 mg/mL和1.6 mg/mL濃度分別處理24 h、48 h和72 h，肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且48 h和72 h的細(xì)胞增殖抑制率均高于24 h（P＜0.01）。不同濃度作用24 h、48 h和72 h的細(xì)胞增殖抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），且0.8 mg/mL和1.6 mg/mL濃度處理的細(xì)胞增殖抑制率均高于0.4 mg/mL濃度處理的細(xì)胞增殖抑制率（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度巖黃連水提物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.2 巖黃連水提物抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移能力

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL巖黃連水提物組的細(xì)胞遷移數(shù)分別為 （208.00±7.64） 個(gè)、（176.00±10.20） 個(gè)、（133.00±7.54）個(gè)和（99.70±4.50）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=113.6，P＜0.001），且各濃度巖黃連水提物組的細(xì)胞遷移數(shù)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖 1。

圖1 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組肝癌HepG2細(xì)胞的遷移能力（吉姆薩染色×100）

2.3 巖黃連水提物上調(diào)NF-κBp65 mRNA的表達(dá)

不同濃度巖黃連水提物作用肝癌HepG2細(xì)胞48 h后，RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL巖黃連水提物組NF-κBp65 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為 1.00、1.94 ±0.15、4.41±0.36、26.03±8.28，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.510，P＜0.001）；0.4 mg/mL、0.8 mg/mL 和 1.6 mg/mL 組的 NF-κBp65 mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖 2。

圖2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組肝癌HepG2細(xì)胞NF-κBp65 mRNA 的表達(dá)

2.4 巖黃連水提物上調(diào)NF-κBp65蛋白的表達(dá)

不同濃度巖黃連水提物作用肝癌HepG2細(xì)胞48 h后，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL巖黃連水提物組NF-κBp65蛋白表達(dá)量分別為 0.50±0.04、0.77±0.08、1.05±0.15、1.44±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=60.380，P＜0.001）；0.4 mg/mL、0.8 mg/mL 和 1.6 mg/mL 組 NF-κBp65蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖3。

圖3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同處理組肝癌HepG2細(xì)胞NF-κBp65蛋白的表達(dá)

3 討論

目前原發(fā)性肝癌治療效果尚不理想，尤其是中晚期肝癌，多學(xué)科綜合治療是有效的治療模式。研究顯示中醫(yī)藥治療在肝癌防治中有一定作用［5］。巖黃連具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效，常用于治療肝炎、肝癌，但目前尚無(wú)國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)揮作用的有效成分亦不明確。半體內(nèi)法抗腫瘤實(shí)驗(yàn)［6］發(fā)現(xiàn)，巖黃連堿在1∶300濃度下對(duì)小白鼠肉瘤180、小白鼠腹水型肝癌、小白鼠艾氏腹水癌及大白鼠癌肉瘤256細(xì)胞均有顯著的抑制作用。本研究采用不同濃度巖黃連水提物作用于肝癌HepG2細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巖黃連水提物濃度在 0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL 下作用 24 h、48 h，肝癌HepG2細(xì)胞增殖均受抑制，其中在1.6 mg/mL濃度下作用48 h表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制作用，因此采用Transwell法檢測(cè)48 h時(shí)不同濃度巖黃連水提物對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力的影響，發(fā)現(xiàn)0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL巖黃連水提物組的細(xì)胞遷移數(shù)均低于對(duì)照組，說(shuō)明巖黃連水提物可降低肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用。有研究表明同一味藥物所含成分不同、劑量變化、采收時(shí)節(jié)、炮制方法、入藥部位、配伍不同、機(jī)體狀態(tài)等都可使中藥顯示出雙向調(diào)節(jié)作用［7］。本研究在作用 72 h 時(shí)，0.8 mg/mL、1.6 mg/mL巖黃連水提物仍表現(xiàn)為抑制作用，但0.4 mg/mL卻表現(xiàn)為促進(jìn)作用，體現(xiàn)了巖黃連水提物雙向調(diào)節(jié)作用，但其作用機(jī)制不明。

肝癌的發(fā)生與炎癥密切相關(guān)，炎癥在肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有促進(jìn)作用［8］。NF-κB是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，p65和p50是其活性形式的主要部分，可參與多種基因表達(dá)與調(diào)控，在肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用［9］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列受NF-κBp65調(diào)控的基因，這些靶基因產(chǎn)物可廣泛參與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡等生理和病理過(guò)程［10］。Wang 等［11］研究發(fā)現(xiàn)miR503HG通過(guò)減少p52穩(wěn)定性和p65mRNA，影響NF-κB途徑和異質(zhì)性核糖體蛋白A2/B1泛素化，從而抑制肝細(xì)胞癌遷移。Chen等［12］研究報(bào)道白楊素通過(guò)影響MAPK和NF-κB信號(hào)通路抑制黑色素瘤細(xì)胞A375遷移和侵襲。巖黃連具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效，其活性成分小檗堿型生物堿類(lèi)化合物小檗堿、四氫非洲防己堿等有潛在的抗HBV活性和肝保護(hù)活性［13］。Li等［14］研究證實(shí)巖黃連中有效成分小檗堿可通過(guò)NF-kBp65通路抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，發(fā)揮對(duì)肝癌的抗腫瘤活性。Dai等［15］通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿與HMQ1611聯(lián)合能抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究分別采用Western blot和RT-qPCR檢測(cè)不同濃度巖黃連水提物作用肝癌HepG2細(xì)胞48 h后NF-κBp65蛋白和mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果不同濃度巖黃連水提物作用后NF-κBp65蛋白和mRNA表達(dá)均升高，提示巖黃連水提物可能通過(guò)上調(diào)NF-κBp65表達(dá)抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移。有研究報(bào)道哺乳動(dòng)物細(xì)胞中NF-κBp65與p50結(jié)合形成p65/p50二聚體，在靜止?fàn)顟B(tài)下，NF-κB 由 p50、p65 和 IκB 組成異源三聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中。本研究肝癌HePG2細(xì)胞可能在巖黃連水提物作用下，導(dǎo)致NF-κBp65活化，然后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并在相應(yīng)的靶基因上與特定的DNA結(jié)合，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖與遷移作用［16］，但是否通過(guò)巖黃連的小檗堿成分調(diào)節(jié)NF-kBp65通路而發(fā)揮抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖、遷移的作用未知。此外中藥是多靶點(diǎn)、多層次、多階段綜合作用的結(jié)果，本研究采用的巖黃連水提物是一種復(fù)合物，含有多種化合物，作用機(jī)制復(fù)雜，因此其對(duì)肝癌增殖、遷移作用的機(jī)制及其有效成分仍有待進(jìn)行系統(tǒng)藥理學(xué)研究證實(shí)。