過表達(dá)THBS2對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

董婷婷 戴盛康 龍穎 伍光騰 馮一鳴 徐勛 盧艷 姚德生

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，與人乳頭狀瘤病毒持續(xù)感染關(guān)系密切［1］。宮頸癌的治療主要以手術(shù)、放療和化療為主，但晚期和復(fù)發(fā)患者療效不理想［2］，分子靶向治療為其提供了新的線索。血小板反應(yīng)蛋白 2（thrombospondin-2，THBS2）是 THBS 蛋白家族中的一員，廣泛存在于上皮來源組織的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，對細(xì)胞黏附能力、增殖以及凋亡等有調(diào)節(jié)作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)THBS2在胃癌、前列腺癌和宮頸癌組織中呈低表達(dá)，且可影響患者預(yù)后［4-6］。然而THBS2調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的相關(guān)機(jī)制尚不明確，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌組織中mir-1246呈異常表達(dá)，且證實(shí)THBS2為mir-1246的靶基因［7］。本研究通過在宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中過表達(dá)THBS2，觀察其對SiHa細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)特性的影響，同時建立裸鼠模型，觀察其體外成瘤能力，以探討THBS2在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為其治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞株購自上海吉凱基因公司，用含10%胎牛血清及10 IU/mL青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。DMEM培養(yǎng)基購自美國gibco公司，THBS2過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉凱基因公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，THBS2抗體購自美國Santa Cruz公司，內(nèi)參GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，IX51型熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)上海吉凱基因公司提供的慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)分為3組：THBS2-LV組（轉(zhuǎn)染THBS2過表達(dá)慢病毒的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞）、NC組（轉(zhuǎn)染空載病毒的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞）、空白對照組（正常培養(yǎng)的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染慢病毒72 h后，在實(shí)時熒光顯微鏡下初步觀察轉(zhuǎn)染效率，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 RT-qPCR檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞THBS2 mRNA的表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)嘌呤霉素篩選的THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，采用吸附柱法提取總RNA。按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。THBS2序列：上游引物為5'-AGCTGGTTCAGACAGCCAACTC-3'，下游引物為5'-CATAGTCGTCGTCCCGGTCA-3'；內(nèi)參GAPDH序列：上游引物為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)總體積為 20 μl，其中 cDNA 模板 2 μL、上下游引物分別為 0.8 μL、SYBR混合物10 μL、無菌蒸餾水6.4 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR 反應(yīng) 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共 40個循環(huán)；溶解分析95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s。反應(yīng)結(jié)束后采用2-△△Ct法計(jì)算THBS2的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞THBS2的表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)嘌呤霉素篩選的THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，在細(xì)胞沉淀中加入RIPA蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑混合液于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min。在THBS2-LV組、NC組和空白對照組細(xì)胞蛋白樣品中添加上樣緩沖液，100℃變性5 min。每個凝膠泳道以50 μL蛋白樣品上樣，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于5%的脫脂奶粉中封閉2 h，加入對應(yīng)一抗鼠抗THBS2抗體（體積稀釋比例為1∶100）和鼠抗GAPDH抗體（體積稀釋比例為1∶1 000）在4℃下孵育過夜。加入二抗兔抗鼠（體積稀釋比例為1∶1 000）孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，并用凝膠成像儀觀察分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 CCK-8法檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞增殖能力

取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)嘌呤霉素篩選的THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，以密度為5 000個/孔取100 μL加入96孔板中，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，檢測前每孔加入 10 μL CCK-8 工作液，于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測吸光度值（OD值），記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞凋亡能力

取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)嘌呤霉素篩選的THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，用0.25%不含EDTA的胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，用PBS重懸離心2次，離心后用100 μL 1×Binding Buffer制成細(xì)胞懸液，先后加入5 μL APC AnnexinⅤ和5μL7-ADD染液，常溫孵育15 min后置于冰上，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞遷移能力

取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)嘌呤霉素篩選的THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞長滿后，用已滅菌消毒的200 μL槍頭在細(xì)胞底部劃痕，分別于0 h、24 h、48 h在顯微鏡下拍照，觀察細(xì)胞遷移及愈合能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞侵襲能力

取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)嘌呤霉素篩選的THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞終密度為5×105個/mL。取出于4℃溶解好的Matrigel膠，用DMEM培養(yǎng)基按1∶8稀釋，取80 μL混合液加入Transwell小室上室底部，置于37℃培養(yǎng)箱待Matrigel膠凝固后取出，將100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，下室為含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱24 h，4%多聚甲醛固定30 min，革蘭液染色10 min，晾干。光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算穿模細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

選取4～5周齡雌性胸腺免疫缺陷SPF級15只裸鼠，體重14～17g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，本實(shí)驗(yàn)符合動物倫理學(xué)規(guī)定。取轉(zhuǎn)染后并經(jīng)嘌呤霉素篩選的THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，于對數(shù)生長期收集細(xì)胞，用PBS重懸。15只裸鼠分為3組，每組5只，分別接種THBS2-LV組、NC組以及空白對照組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，每只裸鼠接種量為1×107個細(xì)胞200 μL，注射于裸鼠腹股溝上脊柱旁皮下。于注射后7 d裸鼠皮下可觸摸到結(jié)節(jié)，每3 d用游標(biāo)卡尺測量瘤體長徑（L）和短徑（W），按照公式V（mm3）=（L×W2）/2 計(jì)算瘤體體積，并繪制曲線，于注射后第3周處死裸鼠，分離皮下瘤體，繪制瘤體生長曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染慢病毒72 h后，在熒光顯微鏡下觀察THBS2-LV組和NC組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，可見兩組表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞占比均大于80%，可初步判定慢病毒成功轉(zhuǎn)染宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，見圖1。

圖1 慢病毒轉(zhuǎn)染宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的熒光及白光照片（×100）

2.2 轉(zhuǎn)染過表達(dá)THBS2慢病毒后宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中THBS2 mRNA的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，THBS2-LV組THBS2 mRNA的相對表達(dá)量為283 399.05±524 79.70，NC組和空白對照組分別為1.32±0.14和1.00±0.11，THBS2-LV組THBS2 mRNA的表達(dá)量較NC組和空白對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，0.003），NC組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.765），見圖2。

圖2RT-qPCR檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中THBS2 mRNA的表達(dá)

2.3 轉(zhuǎn)染過表達(dá)THBS2慢病毒后宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中THBS2蛋白的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，THBS2-LV組THBS2蛋白表達(dá)量為 1.45±0.19，明顯高于 NC 組（0.87±0.20）和空白對照組（0.84±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.003，0.002），NC組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.825），見圖 3。

圖3 Western blot檢測宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中THBS2蛋白的表達(dá)

2.4 轉(zhuǎn)染過表達(dá)THBS2慢病毒對宮頸磷癌SiHa細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，THBS2-LV組、NC組和空白對照組OD值分別0.74±0.08、1.23±0.02和1.25±0.00，THBS2-LV組細(xì)胞生長速度明顯低于NC組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），NC組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.765），見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染后不同處理組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的增殖能力

2.5 轉(zhuǎn)染過表達(dá)THBS2慢病毒對宮頸磷癌SiHa細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，THBS2-LV組、NC組和空白對照組的細(xì)胞凋亡率分別為（21.40±1.20）%、（16.05±1.46）%和（13.91±2.62）。THBS2-LV 組細(xì)胞凋亡率高于NC組和空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014，0.003），NC組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.221），見圖 5。

圖5 轉(zhuǎn)染后不同處理組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的凋亡率

2.6 轉(zhuǎn)染過表達(dá)THBS2慢病毒對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后THBS2-LV組、NC組和空白對照組細(xì)胞穿膜數(shù)分別為（44.20±4.21）個、（71.80±5.63）個和（68.40±7.40）個，THBS2-LV組細(xì)胞穿膜數(shù)較NC組和空白對照組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），NC組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.380），見圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染后不同處理組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的侵襲能力（×200）

2.7 轉(zhuǎn)染過表達(dá)THBS2慢病毒對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞遷移能力的影響

轉(zhuǎn)染72 h后，THBS2-LV組的細(xì)胞遷移率為（51.01±7.40）%，NC 組和空白對照組分別為（71.05±8.40）%和（69.58±13.80）%。THBS2-LV 組細(xì)胞遷移率較NC組和空白對照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014，0.009），NC組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.824），見圖 7。

圖7 轉(zhuǎn)染后不同處理組宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的遷移能力（×100）

2.8 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

THBS2-LV組成瘤率為80%，NC組及空白對照組成瘤率均為100%。第22天處死裸鼠，結(jié)果顯示，接種THBS2-LV組細(xì)胞的裸鼠腫瘤平均體積為（218.26±72.44）mm3，明顯小于接種NC組細(xì)胞裸鼠的腫瘤平均體積（416.96±88.46）mm3和接種空白對照組細(xì)胞裸鼠的腫瘤平均體積（403.64±103.12）mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004，0.006），NC組和空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.817），見圖8、圖9、表1。

表1 實(shí)驗(yàn)期間裸鼠皮下腫瘤體積的變化

圖8 不同處理組裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)瘤體大體形態(tài)

圖9 實(shí)驗(yàn)期間不同處理組裸鼠皮下腫瘤體積的生長曲線

3 討論

中國每年新發(fā)宮頸癌病例占全球的五分之一［8］。近年來，人乳頭狀瘤病毒預(yù)防性疫苗的應(yīng)用使宮頸癌得到有效預(yù)防［9］。手術(shù)和放療可治愈大部分早期宮頸癌患者，但晚期和復(fù)發(fā)患者療效不理想。分子靶向治療為這類患者的治療提供了新的思路，而尋找敏感的腫瘤標(biāo)志物成為研究重點(diǎn)。

Bornstein等［10］于小鼠基因測序中首先發(fā)現(xiàn)THBS2，其為THBS蛋白家族中的一員，含有Ⅰ型重復(fù)區(qū)域結(jié)構(gòu)，在抗血管生成中起重要作用［3，11］。近年在多種類型腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)THBS2在癌組織中呈低表達(dá)，并影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。Sun等［5］在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)THBS2在癌組織中呈低表達(dá)，而THBS2過表達(dá)的MKN-45細(xì)胞和SGC-7901細(xì)胞在軟瓊脂上形成更少集落，并促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡。Zhou等［12］在宮頸癌研究中發(fā)現(xiàn)miR-20a通過THBS2抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Slavin等［6］研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中THBS2呈低表達(dá)，在癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中敲低THBS2可中斷雌激素受體α介導(dǎo)的細(xì)胞侵襲抑制。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在宮頸鱗癌組織中mir-1246呈高表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，且THBS2為mir-1246的靶基因［7］，以上研究提示THBS2可能是治療宮頸癌的新靶點(diǎn)。為探討THBS2對宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本研究通過轉(zhuǎn)染THBS2過表達(dá)慢病毒構(gòu)建過表達(dá)THBS2的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染過表達(dá)THBS2慢病毒的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞中THBS2 mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染空載病毒和正常培養(yǎng)的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，說明本研究成功建立了穩(wěn)定過表達(dá)THBS2的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

宮頸鱗癌細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移是患者死亡率高的主要原因之一，研究其侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對改善患者預(yù)后有重要意義。本研究通過Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀和CCK-8法觀察細(xì)胞侵襲、遷移、凋亡和增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)THBS2的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力較NC組和空白對照組明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高；其中細(xì)胞增殖率較NC組和空白對照組降低，與肺腺癌研究中下調(diào)THBS2可抑制A549細(xì)胞增殖的結(jié)論相悖，可能與肺腺癌免疫相關(guān)調(diào)節(jié)的特異性有關(guān)［13］，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)THBS2可降低宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，且增強(qiáng)細(xì)胞凋亡能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證THBS2在宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究建立裸鼠模型，觀察接種過表達(dá)THBS2慢病毒宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其皮下成瘤能力明顯低于接種NC組和空白對照組細(xì)胞的裸鼠，且腫瘤平均體積明顯縮小，與Calabro等［14］在裸鼠實(shí)驗(yàn)中的觀察結(jié)果一致，說明THBS2可抑制裸鼠皮下宮頸鱗癌生長。可能的作用機(jī)制是THBS2具有備解素樣Ⅰ 型重復(fù)區(qū)域結(jié)構(gòu)，可作為血管生成抑制劑，通過對腫瘤血管生成抑制作用，阻止腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移［15-17］。此外，THBS2抑制腫瘤進(jìn)展的機(jī)制還可能與影響基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，以及參與TGF-β通路調(diào)控相關(guān)［18-19］。

綜上所述，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)上調(diào)THBS2表達(dá)可抑制宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力并促進(jìn)其凋亡，同時在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證過表達(dá)THBS2可抑制裸鼠皮下成瘤能力和腫瘤生長，THBS2可能是宮頸鱗癌的抑癌基因，可作為該疾病的潛在治療靶點(diǎn)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。