NCLX介導(dǎo)的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

金明朋 尹純 尚英英 曹海燕 吉曉瑩 任婷婷 邢金良 吳有盛

肝癌是目前全世界第6大常見癌癥，也是全球癌癥第4大死亡原因，每年約有841 000例新發(fā)病例和782 000例死亡病例［1］。我國(guó)是肝癌高發(fā)區(qū)，近年來肝癌在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)［2］，嚴(yán)重威脅人民健康。線粒體通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝等功能在癌癥的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。研究證實(shí)線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變?cè)诖龠M(jìn)癌癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用［3］。在線粒體眾多功能中，腫瘤細(xì)胞線粒體鈣穩(wěn)態(tài)的變化備受關(guān)注［4］。鈣離子可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等。已有研究表明，一些腫瘤細(xì)胞存在特定的Ca2+通道、泵或交換劑被上調(diào)或下調(diào)［5-6］。線粒體鈉鈣交換體 （mitochondrial Na+/Ca2+exchanger，NCLX）是線粒體鈣流出的通道，在調(diào)控線粒體鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［7］。上述結(jié)果提示NCLX表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，但目前國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)NCLX與肝癌關(guān)系的深入研究。本研究通過構(gòu)建干涉和過表達(dá)NCLX的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系，觀察NCLX介導(dǎo)的線粒體鈣穩(wěn)態(tài)在肝癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，初步探索線粒體鈣對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為尋找肝癌的潛在治療靶點(diǎn)提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

肝癌細(xì)胞系SNU-739和SNU-368購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。NCLX擴(kuò)增引物由上海生工合成，pcDNA3.1（+）載體、pSilencer3.0載體、脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000）、Rhod-2-AM、PVDF 膜、胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ、T4 DNA 連接酶、DNA marker DL2000、DH5a感受態(tài)細(xì)菌菌株購(gòu)自日本TaKaRa公司，細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自美國(guó)Corning公司，5×蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液購(gòu)自西安晶彩科技有限公司，抗NCLX多抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，EdU試劑盒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司，Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司，6孔、24孔、96孔板購(gòu)自美國(guó)Axygene公司，共聚焦專用玻璃購(gòu)自無錫耐思生物科技有限公司，激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌細(xì)胞SNU-739、SNU-368用含10%FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞用胰蛋白酶消化、傳代。

1.3 構(gòu)建穩(wěn)定干涉或過表達(dá)NCLX基因的肝癌細(xì)胞株

采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，肝癌細(xì)胞SNU-739和SNU-368各分為4組：SNU-739-shCtrl組、SNU-368-shCtrl組（分別用空載體shCtrl轉(zhuǎn)染SNU-739和SNU-368細(xì)胞），SNU-739-shNCLX組、SNU-368-shNCLX組（用pSliencer3.0-shNCLX轉(zhuǎn)染SNU-739和SNU-368細(xì)胞，構(gòu)建干涉NCLX的SNU-739和SNU-368細(xì)胞）；SNU-739-EV組、SNU-368-EV組（用空載體EV轉(zhuǎn)染SNU-739和SNU-368細(xì)胞），SNU-739-NCLX組、SNU-368-NCLX組（用 pcDNA3.1(+)-NCLX轉(zhuǎn)染 SNU-739和SNU-368細(xì)胞，構(gòu)建過表達(dá)NCLX的SNU-739和SNU-368細(xì)胞）。取適量對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，使24 h后細(xì)胞培養(yǎng)板覆蓋率為70%～80%。轉(zhuǎn)染方式按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)采用4μg質(zhì)粒和8μLLipofectamine 2000每孔進(jìn)行轉(zhuǎn)染。篩選穩(wěn)定干涉和過表達(dá)NCLX克隆株：細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用胰蛋白酶消化，接種1/5細(xì)胞到6孔培養(yǎng)板中，加入含800 μg/mL G418的RPMI 1640培養(yǎng)基，每2～3 d更換1次篩選培養(yǎng)基。細(xì)胞出現(xiàn)單克隆時(shí)，挑取單克隆團(tuán)后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，鑒定篩選有效克隆。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)NCLX蛋白的表達(dá)

取待測(cè)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，PBS洗滌3遍，加入RIPA裂解液冰上孵育30 min，4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定NCLX蛋白濃度后，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min使其變性。按每孔60 μg上樣，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在5%脫脂奶粉中室溫封閉 1 h，加入一抗 NCLX 抗體（1∶1000）和 β-actin 抗體（1∶3 000）4℃孵育過夜，TBST充分洗膜 3次后加入羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫孵育 1 h，TBST 洗滌 3次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NCLX蛋白的表達(dá)。用Image J軟件分析，以目的蛋白條帶灰度值和內(nèi)參β-actin的蛋白條帶灰度值比值確定目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Rhod-2-AM染色檢測(cè)線粒體鈣水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于25 mm玻底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將細(xì)胞置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。配制1 mmol/L的Rhod-2-AM 母液：50 μg Rhod-2-AM 粉末用 44.5 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解，分裝，-20℃避光密封保存。使用時(shí)用含Ca2+、Mg2+的HBSS緩沖液以4∶1 000的比例配制4 μmol/L工作液；取出細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用含Ca2+、Mg2+的 HBSS 緩沖液洗滌細(xì)胞 3 次；加入 600 μL Rhod-2-AM工作液，37℃孵育40 min，用HBSS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，去除殘留的Rhod-2-AM工作液，然后加入HBSS溶液覆蓋細(xì)胞，37℃孵育30 min；用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng)545 nm，發(fā)射波長(zhǎng)565 nm。

1.6 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔1～4×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用細(xì)胞培養(yǎng)液1∶1 000稀釋EdU溶液為50 μM EdU工作液；每孔加入500 μL EdU工作液，37℃孵育2h，PBS清洗細(xì)胞2次，加500 μL 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min；加入 500 μL 2 mg/mL甘氨酸孵育5 min，然后用PBS清洗以中和多聚甲醛，加入500 μL 0.5%TritonX-100的PBS，脫色搖床孵育10 min后用PBS清洗；加入提前配置好的1×Apollo?染色反應(yīng)液400 μL避光孵育30 min，加入滲透劑后分別用甲醇和PBS洗滌；加1×Hoechst 33342反應(yīng)液進(jìn)行DNA染色，熒光顯微鏡拍照計(jì)數(shù)。

1.7 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為100 μL/孔，加入 96 孔板，2×103個(gè)/孔；5%CO2、37 ℃孵育 24 h，顯微鏡觀察；每孔加入20 μL MTS溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)2 h；在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD為490 nm處測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無EDTA胰酶消化，1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，棄上清液。用提前預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，1 000 r/min離心5 min；用400 μL 1×Binding Buffer緩沖液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106個(gè)/mL；向上述細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC染料，輕輕混勻，4℃冰箱中避光條件下孵育15 min；加入10 μL PI染料，輕輕混勻，于4℃冰箱中避光條件下孵育5 min；1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布且方差齊性的兩組數(shù)據(jù)之間的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

構(gòu)建的真核表達(dá)載體pSliencer3.0-shNCLX、pcDNA3.1（+）-NCLX經(jīng)華大基因生物公司測(cè)序確認(rèn)，所構(gòu)建的載體序列正確（圖1），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 干涉和過表達(dá)NCLX載體測(cè)序結(jié)果

2.2 免疫印跡法檢測(cè)NCLX蛋白的表達(dá)

免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示（圖2），SNU-739-shCtrl組和SNU-739-shNCLX組蛋白表達(dá)量分別為0.96±0.03 和 0.59±0.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）；SNU-739-EV組和SNU-739-NCLX組蛋白表達(dá)量分別為1.02±0.03和 1.47±0.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）；SNU-368-shCtrl組和SNU-368-shNCLX組蛋白表達(dá)量分別為1.16±0.08和0.69±0.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）；SNU-368-EV 組和 SNU-368-NCLX 組蛋白表達(dá)量分別為0.94±0.06和2.41±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示穩(wěn)定干涉和過表達(dá)NCLX的肝癌細(xì)胞系構(gòu)建成功。

圖2 免疫印跡法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中NCLX蛋白的表達(dá)

2.3 Rhod-2-AM染色檢測(cè)線粒體鈣水平

Rhod-2-AM染色結(jié)果顯示（圖3），SNU-739-shCtrl組和SNU-739-shNCLX組的相對(duì)熒光值分別為0.97±0.03和 1.53±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SNU-739-EV組和SNU-739-NCLX組的相對(duì)熒光值分別為1.04±0.06和 0.67±0.06，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.01）；SNU-368-shCtrl組和SNU-368-shNCLX組的相對(duì)熒光值分別為1.03±0.01 和 1.61±0.02，SNU-368-EV 組和 SNU-368-NCLX組的相對(duì)熒光值分別為1.00±0.03和0.46±0.06，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示干涉 NCLX后肝癌細(xì)胞線粒體鈣明顯增多，而NCLX過表達(dá)的肝癌細(xì)胞線粒體鈣明顯減少。

圖3 線粒體鈣Rhod-2-AM的染色結(jié)果

2.4 干涉和過表達(dá)NCLX對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖 4），SNU-739-shCtrl組和SNU-739-shNCLX組96 h時(shí)的相對(duì)應(yīng)OD值分別為0.78±0.04 和 1.18±0.06，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SNU-739-EV組和SNU-739-NCLX組在96 h相對(duì)應(yīng)的OD值分別為0.87±0.05和0.59±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）；SNU-368-shCtrl組和 SNU-368-shNCLX在96 h相對(duì)應(yīng)的OD值分別為0.70±0.03和1.01±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SNU-368-EV組和SNU-368-NCLX組在96 h相對(duì)應(yīng)的OD值分別為0.76±0.04 和 0.52±0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示干涉NCLX明顯促進(jìn)了肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而NCLX過表達(dá)則抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖4 干涉和過表達(dá)NCLX對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.5 干涉和過表達(dá)NCLX對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

EdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5），SNU-739-shCtrl組和SNU-739-shNCLX組的細(xì)胞增殖率分別為（27.04±1.94）%和（48.94±5.60）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.02）；SNU-739-EV 組和 SNU-739-NCLX 組的細(xì)胞增殖率分別為（32.62±2.38）%和（23.44±1.28）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.03）；SNU-368-shCtrl組和SNU-368-shNCLX組的細(xì)胞增殖率分別為（30.75±1.33）%和（40.33±1.45）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SNU-368-EV組和SNU-368-NCLX組的細(xì)胞增殖率分別為（28.67±2.40）%和（20.33±1.45）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.04），提示干涉NCLX明顯促進(jìn)了肝癌細(xì)胞增殖，而NCLX過表達(dá)明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖。

圖5 干涉和過表達(dá)NCLX對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

2.6 干涉和過表達(dá)NCLX對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示（圖6），SNU-739-shCtrl組和SNU-739-shNCLX組的細(xì)胞凋亡率分別為（8.07±0.44）%和（4.03±0.44）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SNU-739-EV組和SNU-739-NCLX組的細(xì)胞凋亡率分別為（8.23±0.34）%和（14.30±0.49）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SNU-368-shCtrl組和 SNU-368-shNCLX組的細(xì)胞凋亡率分別為（9.37±0.41）%和（3.60±0.20）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；SNU-368-EV組和SNU-368-NCLX組的細(xì)胞凋亡率分別為（10.20±0.41）和（20.30±0.49），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示干涉NCLX抑制了肝癌細(xì)胞凋亡，而NCLX過表達(dá)則促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

圖6 干涉和過表達(dá)NCLX對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

線粒體的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)平衡是線粒體合成ATP和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以外的又一重要功能，一方面，線粒體鈣可調(diào)控細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子水平，并對(duì)鈣信號(hào)振蕩有緩沖作用［5，8-9］；另一方面，線粒體還可通過調(diào)節(jié)內(nèi)部鈣穩(wěn)態(tài)進(jìn)一步影響其他功能，如活性氧ROS生成、氧化磷酸化進(jìn)程以及線粒體凋亡通路活化等，最終在細(xì)胞生存狀態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［10-11］。

NCLX是鈉鈣交換蛋白超家族的成員之一，該家族蛋白具有α1/α2重復(fù)結(jié)構(gòu)形成催化陽(yáng)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)部件［12-13］。NCLX作為線粒體鈣排出通道，在線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控過程中發(fā)揮作用。已有大量研究報(bào)道NCLX表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在內(nèi)分泌與代謝疾病相關(guān)研究中，高糖環(huán)境下敲低NCLX表達(dá)后，線粒體鈣釋放減少，葡萄糖依賴性胰島素分泌延遲［8］。在心血管疾病相關(guān)研究中，美國(guó)坦普爾大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)缺失NCLX表達(dá)的小鼠出生后14 d的存活率不到13%，致死原因多為心肌功能障礙和暴發(fā)性心力衰竭，證明了NCLX低表達(dá)能干擾線粒體穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而嚴(yán)重影響心臟的正常功能［7］。在神經(jīng)生物研究領(lǐng)域，有研究表明NCLX表達(dá)沉默會(huì)顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移能力［14］。本研究通過構(gòu)建干涉和過表達(dá)NCLX肝癌細(xì)胞系，檢測(cè)細(xì)胞線粒體鈣水平，并通過增殖實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力和凋亡情況，研究結(jié)果顯示干涉NCLX誘導(dǎo)的線粒體鈣水平升高促進(jìn)了肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而過表達(dá)NCLX誘導(dǎo)的線粒體鈣水平下降抑制了肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本研究首次證明了NCLX表達(dá)水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，為后續(xù)開發(fā)針對(duì)NCLX的肝癌靶向治療藥物提供了基礎(chǔ)。