東北自然發(fā)酵酸菜中耐低溫優(yōu)良乳酸菌菌種的篩選

張曉黎 吳興壯 高雅

摘要：在10 ℃低溫狀態(tài)下，利用分離得到的乳酸菌菌種開展應(yīng)用試驗(yàn)。接種白菜進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中分別測(cè)定菌種產(chǎn)酸速度、產(chǎn)酸量、降解亞硝酸鹽能力和乳酸菌素產(chǎn)量，以成品酸菜風(fēng)味為最終考核指標(biāo)，篩選出2株產(chǎn)酸速度快、耐酸強(qiáng)、降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)、乳酸菌素產(chǎn)量高的耐低溫乳酸菌菌株。

關(guān)鍵詞：酸菜;乳酸菌;菌種篩選;耐低溫

中圖分類號(hào)：TS201.3? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：1674-1161（2018）05-0020-03

乳酸菌是酸菜發(fā)酵過程中起主要作用的微生物菌群，其生物學(xué)特性和發(fā)酵特性直接影響著酸菜的發(fā)酵效果。采用低溫乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)酸菜，可以獲得酸味柔和、風(fēng)味飽滿的酸菜。乳酸菌作為中溫型微生物，一般在低于15 ℃的條件下生長(zhǎng)緩慢，在10 ℃以下生長(zhǎng)微弱、甚至很難生長(zhǎng)。目前酸菜工業(yè)化生產(chǎn)所應(yīng)用的乳酸菌菌種多數(shù)為常溫下分離所得，適宜的發(fā)酵溫度為22～30 ℃，低于10 ℃其生長(zhǎng)受到抑制。在東北地區(qū)，發(fā)酵酸菜所用的大白菜大多在10月中下旬大量采收，此時(shí)外界氣溫一般已經(jīng)降到15 ℃以下，最低氣溫甚至達(dá)到0 ℃左右。采用人工接種乳酸菌生產(chǎn)酸菜，必須人為提高生產(chǎn)環(huán)境溫度，才能充分發(fā)揮乳酸菌菌種優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致能源消耗大、生產(chǎn)成本高。因此，目前東北地區(qū)的酸菜生產(chǎn)以自然發(fā)酵為主，發(fā)酵過程中除了乳酸菌外還有其他微生物同時(shí)繁殖生長(zhǎng)，為了防止酸菜產(chǎn)品漲袋，往往需要人為添加防腐劑，產(chǎn)品質(zhì)量無法保證，對(duì)酸菜產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展極為不利。

本課題以東北農(nóng)家低溫自然發(fā)酵酸菜中分離、鑒定的乳酸菌菌種為研究對(duì)象，經(jīng)過馴化篩選獲得性能優(yōu)良的耐低溫乳酸菌菌種，為低溫環(huán)境條件下規(guī)?；a(chǎn)酸菜提供可靠、便捷的乳酸菌菌種，可以縮短低溫環(huán)境條件下酸菜生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，且充分發(fā)酵后產(chǎn)品無需添加防腐劑，確保產(chǎn)品品質(zhì)和食用安全性，為乳酸菌發(fā)酵酸菜規(guī)?；a(chǎn)提供了有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 乳酸菌菌種 L1，L2，L3，L4，L5：從低溫自然發(fā)酵酸菜中分離鑒定保存的耐低溫乳酸菌菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，K2HPO4 2 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，加蒸餾水至1 000mL，調(diào)節(jié)pH值為6.5，121 ℃下滅菌20 min。酸菜生產(chǎn)種培養(yǎng)基：200 g白菜，50 g白糖，加水1 000 mL，水燒開后小火煮30 min，然后將白菜濾出，濾液調(diào)節(jié)pH值為6.5，121 ℃下滅菌20 min。

1.2 儀器設(shè)備

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司;BL-100G型全自動(dòng)立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;XSP-580A型生物顯微鏡：上海中恒儀器有限公司;756型紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司;PHS-3C型精密酸度計(jì)：上海曉霄試驗(yàn)設(shè)備儀器有限公司;GDYQ-901SC2型食品亞硝酸鹽快速測(cè)定儀：長(zhǎng)春吉大小天鵝儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低溫乳酸菌的馴化 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）分別接入MRS液體培養(yǎng)基中，放置于冰箱中，依次在15，13，11，9 ℃下培養(yǎng)，使其逐步適應(yīng)低溫環(huán)境。然后以經(jīng)過低溫馴化的菌種作為種源進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 供試菌株產(chǎn)酸能力的測(cè)定 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）分別接入MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，然后將待測(cè)菌株的培養(yǎng)液以相同的接種量（1%）接入酸菜生產(chǎn)種培養(yǎng)基中，在10 ℃下培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定培養(yǎng)液的pH值，觀察產(chǎn)酸情況;用紫外分光分度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度值（OD值），根據(jù)培養(yǎng)液的渾濁程度來判斷菌株生長(zhǎng)情況。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 供試菌株降解亞硝酸鹽能力的測(cè)定 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）依次接種到MRS培養(yǎng)基和酸菜生產(chǎn)種培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁，然后將生產(chǎn)種接入白菜中壓實(shí)密封，置于10 ℃的低溫環(huán)境下發(fā)酵，每隔2 d監(jiān)測(cè)其亞硝酸鹽含量，判斷其降解亞硝酸鹽的能力。

1.3.4 供試菌株乳酸菌素產(chǎn)量的測(cè)定 乳酸菌素是由乳酸菌生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的一種具有活性的多肽或蛋白質(zhì)，有一定的抑菌作用。通過測(cè)量抑菌圈的大小來判斷乳酸菌素的含量。采用瓊脂擴(kuò)散法，以金黃色葡萄球菌為指示菌，將受試致病菌懸液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板（厚度4 mm）上，然后在瓊脂上打孔（孔徑5 mm）并封底，將5株待測(cè)菌株的代謝產(chǎn)物加滿孔中，培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈大小判斷其抑菌效果，從而推斷其產(chǎn)生乳酸菌素的含量。每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 供試菌株發(fā)酵酸菜的感官評(píng)價(jià) 將5株乳酸菌菌種（L1，L2，L3，L4，L5）按照1.3.3的方法進(jìn)行擴(kuò)繁，接入白菜發(fā)酵一個(gè)月后，對(duì)酸菜的風(fēng)味、口感、色澤、質(zhì)地進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：風(fēng)味，有發(fā)酵的酸香味為5分，酸味刺鼻為0分;口感，酸爽可口為5，酸味不正為0分;色澤，淺黃有光澤為5分，灰暗無光澤為0分;質(zhì)地，脆嫩為5分，質(zhì)地發(fā)軟為0分。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株產(chǎn)酸能力

不同菌株發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值變化情況見表1。

由表1可知：L1發(fā)酵前期產(chǎn)酸較快，后期產(chǎn)酸尚可;L3和L5前期產(chǎn)酸較慢，但后期產(chǎn)酸較好;L2整個(gè)發(fā)酵過程中產(chǎn)酸情況都不理想;L4較L2稍好，但比L1，L3，L5較差。

2.2 供試菌株生長(zhǎng)情況

不同菌株發(fā)酵過程中發(fā)酵液光密度值（OD值）變化情況見表2。

由表2可知：L1，L3發(fā)酵初期生長(zhǎng)速率較快，發(fā)酵后期尚可;L5雖然前期生長(zhǎng)較慢，但后期生長(zhǎng)速度較快，甚至超越了L1。

2.3 供試菌株不同發(fā)酵時(shí)期亞硝酸鹽含量

不同菌株發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量測(cè)定情況見表3。

由表3可知：L3在發(fā)酵26 d時(shí)，亞硝酸鹽含量最低;L1與L5稍微高一點(diǎn)，但區(qū)別不大;L2和L4較差，但均遠(yuǎn)低于國標(biāo)規(guī)定的亞硝酸鹽含量。

2.4 供試菌株代謝產(chǎn)物乳酸菌素含量的測(cè)定

不同菌株抑菌圈大小測(cè)定結(jié)果見表4。

由表4可知：L3抑制葡萄球菌效果較好;L1與L5抑菌效果尚可;L2和L4抑菌效果較差。

2.5 供試菌株發(fā)酵酸菜的感官評(píng)價(jià)

不同菌株發(fā)酵酸菜的品質(zhì)評(píng)價(jià)情況見表5。

由表5可知：L1最好，L3和L5稍差，但明顯優(yōu)于L2和L4。

綜合以上各組試驗(yàn)結(jié)果以及酸菜品質(zhì)評(píng)分情況，從5株分離鑒定的乳酸菌種中篩選出各項(xiàng)性能指標(biāo)良好、發(fā)酵酸菜品質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌菌種為L(zhǎng)1和L3。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)篩選的耐低溫乳酸菌菌種可以在酸菜發(fā)酵期間降低對(duì)環(huán)境溫度的要求，從而為企業(yè)節(jié)省能源、降低成本;并且通過篩選得到各項(xiàng)性能優(yōu)良的乳酸菌菌種，可以保證生產(chǎn)出的酸菜無論品質(zhì)還是安全性都大大提高。對(duì)于目前采用自然發(fā)酵生產(chǎn)酸菜的企業(yè)而言，應(yīng)用乳酸菌菌種發(fā)酵改進(jìn)酸菜生產(chǎn)工藝，與以往添加防腐劑相比，并不會(huì)增加成本，同時(shí)可縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品質(zhì)量，使酸菜更加營養(yǎng)、安全、美味;對(duì)于目前利用乳酸菌接種生產(chǎn)酸菜的企業(yè)而言，應(yīng)用耐低溫乳酸菌菌種可以大大降低能耗，減少生產(chǎn)成本，增強(qiáng)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。耐低溫乳酸菌菌種的篩選，有利于直投式乳酸菌酸菜的推廣，可以在很大程度上提高酸菜產(chǎn)品的安全性，對(duì)于有效促進(jìn)酸菜行業(yè)健康有序發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。

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Screening of Lactic Acid Bacteria Resistant to Low Temperature

Pickled Cabbage by Natural Fermented in Northeast China

ZHANG Xiaoli， WU Xingzhuang， GAO Ya

（Institute of Food and Processing， Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161， China）

Abstract： In the condition of 10 ℃ low temperature， the isolated lactobacillus strains were used to carry out the application test. Inoculated cabbage was fermented. In the fermentation process， the acid production rate， acid production amount， nitrite degradation capacity and lactobacillus production were determined. Taking the flavor of finished pickled cabbage as the final evaluation index， 2 strains of low-temperature lactic acid bacteria with fast acid production speed， strong acid resistance， strong ability to degrade nitrite and high lactobacillus production were screened out.

Key words： pickled cabbage; lactic acid bacteria; bacteria screening; low temperature resistant