煙用添加劑生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)進(jìn)展

李 源，韓亞偉，張東鵬，黃麗蘋(píng)，李欣欣

1 煙草制品添加劑概況

作為煙草工業(yè)的一種添加劑，煙用香精香料對(duì)于卷煙增香提味來(lái)說(shuō)具有重要作用，是生產(chǎn)卷煙不可或缺的原料，香精配方屬于卷煙加工企業(yè)的核心機(jī)密之一，香精香料和其他添加劑的使用同一個(gè)卷煙品牌的創(chuàng)立與發(fā)展壯大息息相關(guān)。煙用香精香料是專(zhuān)門(mén)為卷煙加工企業(yè)生產(chǎn)的原料，一般不能用于其他非煙草企業(yè)[1]。

1.1 煙用香精香料分類(lèi)

依據(jù)香料來(lái)源，通常將其分為天然的和合成的兩大類(lèi)，目前己被發(fā)現(xiàn)的天然香料有4 000多種，合成香料更是多達(dá)8 000余種，合成香料中有一個(gè)種類(lèi)稱(chēng)為天然等同香料，指雖然在自然界中存在并己經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是由于自然界中的產(chǎn)量有限，主要采用人工合成的方法以供大量使用，目前煙草加工工業(yè)使用的多為此類(lèi)物質(zhì)。

1.2 煙用香精香料的作用

依據(jù)對(duì)卷煙制品的吸食品質(zhì)貢獻(xiàn)，通常可將煙用香精香料分為不同系列，不同系列具有不同的作用。煙用香精香料的作用集中體現(xiàn)在降低煙氣危害組分和提高卷煙吸食品質(zhì)這2個(gè)方面，合理添加煙用香精香料對(duì)卷煙制品的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)不可或缺，是形成卷煙風(fēng)味和風(fēng)格的重要因素[2]。

1.3 吸煙與健康

卷煙煙氣化學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)指出，卷煙煙氣氣溶膠中已經(jīng)得到確認(rèn)的化學(xué)成分多達(dá)5 000余種。其中，60余種可以認(rèn)定為致癌物，還有一些促癌物和輔助致癌物。1997年，Hoffhlann提出了所謂的Hofifllann名單，總結(jié)出了煙氣混合物中的一部分代表性危害組分，包含13類(lèi)化學(xué)物質(zhì)，共計(jì)44種[3]。

1972年研究顯示，低焦油煙卷對(duì)人體身心健康的影響程度相對(duì)較小。此后，眾多國(guó)家與地區(qū)推行了控制焦油和尼古丁含量的嚴(yán)格法律，如歐盟法律允許的單支最高焦油含量從1993年的15 mg到1998年12 mg，再到2004年的10 mg。再看我國(guó)，2002年底的時(shí)候，我國(guó)單支卷煙的焦油含量加權(quán)平均值為14.7 mg，2010年底時(shí)降到了11.5 mg；截至2017年5月，降到了10.3 mg， 含量8 mg以下低焦油卷煙全國(guó)銷(xiāo)量達(dá)到了創(chuàng)歷史的366.14萬(wàn)箱，同比增長(zhǎng)8.20%，并且含量6 mg以下的低焦油卷煙全國(guó)銷(xiāo)量達(dá)到了前所未有的58.10萬(wàn)箱，同比增長(zhǎng)10.94%[4]。

2 煙用添加劑生物學(xué)評(píng)價(jià)方法

安全性評(píng)價(jià)，就是從毒理學(xué)的角度，研究外源性物質(zhì)對(duì)機(jī)體的毒理作用機(jī)理，檢測(cè)和評(píng)價(jià)該物質(zhì)對(duì)機(jī)體的安全性和安全范圍，從而保持機(jī)體的健康。

目前，最常用的煙草制品安全性評(píng)價(jià)方法是對(duì)焦油量、煙氣一氧化碳量和煙氣煙堿量這三大指標(biāo)的含量進(jìn)行分析評(píng)測(cè)，這三大指標(biāo)也是每年國(guó)家煙草專(zhuān)賣(mài)局用來(lái)衡量各個(gè)煙草工業(yè)企業(yè)煙草制品質(zhì)量的重要參考依據(jù)，涉及煙用添加劑的生物學(xué)評(píng)價(jià)方法則比較少，這顯然是不全面的，煙氣一般都具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性。

2.1 國(guó)外近年來(lái)生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)進(jìn)展

半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，國(guó)際四大煙草工業(yè)集團(tuán)對(duì)卷煙和煙用香精香料的生物學(xué)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了大量基礎(chǔ)性研究工作。從上世紀(jì)90年代初開(kāi)始，雷諾煙草公司以Eclipse卷煙為試驗(yàn)樣品，關(guān)于卷煙生物學(xué)評(píng)價(jià)的研究主要分為2個(gè)方面：①毒理學(xué)試驗(yàn)。如體外毒理學(xué)試驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞毒性和遺傳毒性、核酸加合物分析、小白鼠皮膚外致瘤涂布試驗(yàn)，以及小白鼠呼吸道系統(tǒng)（鼻子、喉嚨、肺葉）的病理解剖分析。②吸煙試驗(yàn)。檢測(cè)分析志愿者的呼吸曲線(xiàn)，血液、尿液中的羥基血色素和尼古丁含量變化，觀察記錄肺部發(fā)炎癥狀。

英美煙草公司的生物學(xué)分析檢測(cè)方法為染色體畸變分析、中性紅細(xì)胞毒性分析、體外煙氣短期細(xì)胞毒性分析、細(xì)菌基因突變與回變——Ames分析、煙氣混合物中Hofifllann產(chǎn)物定量與分析和微核彗星試驗(yàn)。

菲利普·莫里斯煙草公司的生物學(xué)檢測(cè)分析方法為周?chē)h(huán)境卷煙煙氣釋放量測(cè)定與分析、90 d亞慢性毒性分析、體外遺傳毒性及細(xì)胞毒性測(cè)定、臨床試驗(yàn)和煙氣混合物代表性危害成分定量測(cè)定與分析等。

2004年10月10日—10月12日，卷煙產(chǎn)品及煙用香精香料生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)與低焦油煙草制品研發(fā)國(guó)際學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)在杭州舉行。會(huì)上，有關(guān)煙用香精香料生物學(xué)評(píng)價(jià)方面的論文有3篇，分別是考旺斯公司Clements博士的《體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)煙用香精香料的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)》[5]、英美煙草公司Messey博士的《煙用香精香料對(duì)于卷煙煙氣化學(xué)及細(xì)胞毒性的影響》和菲利普·莫里斯煙草公司德國(guó)漢堡研究實(shí)驗(yàn)室Rmer博士的《體內(nèi)測(cè)定分析煙用香精香料的生物學(xué)活性》。

2002年，國(guó)際煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）成立了煙用香精香料體外生物學(xué)評(píng)價(jià)工作組，依據(jù)國(guó)際公認(rèn)的體外生物學(xué)試驗(yàn)測(cè)定程序并加以?xún)?yōu)化。通過(guò)廣泛的文獻(xiàn)閱讀分析和近4年的研究工作，工作組建立了3種評(píng)價(jià)煙草制品毒理學(xué)指標(biāo)的試驗(yàn)方法：①推薦使用鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變?cè)囼?yàn)進(jìn)行細(xì)菌誘變?cè)囼?yàn)；②推薦使用小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)或染色體畸變?cè)囼?yàn)或彗星試驗(yàn)進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳毒性分析；③推薦使用中性紅細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞毒性。

從國(guó)際上正在開(kāi)展的煙氣化學(xué)生物學(xué)評(píng)價(jià)方法研究工作來(lái)看，3項(xiàng)生物學(xué)活性測(cè)定指標(biāo)：①細(xì)菌誘變能力；②染色體致畸變能力；③細(xì)胞毒性大小已經(jīng)得到了普遍應(yīng)用。

2.2 國(guó)內(nèi)近年來(lái)生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)進(jìn)展

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)一些科研院校與卷煙工業(yè)企業(yè)充分合作，初步開(kāi)展了一些有關(guān)安全性研究的生物學(xué)試驗(yàn)。中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究與檢測(cè)中心（上海）已經(jīng)公開(kāi)發(fā)布了低焦油低危害卷煙制品（PREP）的某些試驗(yàn)結(jié)果，主要有煙氣組分中巴豆醛和芳香胺含量分析，以及彗星試驗(yàn)、Ames試驗(yàn)、急性亞急性細(xì)胞毒性試驗(yàn)、中性紅細(xì)胞試驗(yàn)、總過(guò)氧化物酶檢測(cè)和小鼠3個(gè)月吸煙亞慢性體內(nèi)毒性試驗(yàn)。

云南中煙下屬的云南煙草科學(xué)研究院基于自身之前在毒理學(xué)領(lǐng)域的研究工作，組建了毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，這是煙草科研機(jī)構(gòu)中的第1個(gè)，逐步探索出一系列靈敏、快速且適用于卷煙煙氣組分生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)的試驗(yàn)方法，確定了幾個(gè)煙氣毒理學(xué)評(píng)價(jià)的安全性指標(biāo)，從宏觀和微觀2個(gè)層次上分別評(píng)價(jià)卷煙煙氣的安全性。建立了5種試驗(yàn)方法用于研究卷煙煙氣混合物的3個(gè)重要毒理學(xué)活性指標(biāo)——卷煙煙氣急性毒性、細(xì)胞毒性和遺傳毒性。系統(tǒng)地將細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于卷煙安全性評(píng)價(jià)中，這在國(guó)內(nèi)是首次。建立了一系列卷煙煙氣生物學(xué)評(píng)價(jià)方法，該體系可進(jìn)行10項(xiàng)指標(biāo)的分析測(cè)定。由其自行設(shè)計(jì)并制造成功的小白鼠被動(dòng)吸煙裝置，已獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利，可用于進(jìn)行煙氣混合物對(duì)被動(dòng)吸煙小鼠所造成的急性亞急性生物學(xué)試驗(yàn)。

鄭州煙草研究院結(jié)合自身特長(zhǎng)，充分利用資源，先后建立了一系列卷煙安全性評(píng)價(jià)體系。建立了卷煙主流煙氣冷凝物的Ames試驗(yàn)方法，挑選對(duì)煙氣混合物敏感的TA98和TA100作為受試體，使用5%S9混合液作為活化系統(tǒng)，這樣一來(lái)，不僅使某些化合物的靈敏度得到了提高，試驗(yàn)結(jié)果也變得更加可靠，新方法更加適用于復(fù)雜的卷煙煙氣混合物組分致回突變性的分析[6]。

來(lái)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所的朱茂祥高級(jí)工程師完成了大量的生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)研究，建立了一系列煙草制品生物學(xué)評(píng)價(jià)體系，主要有關(guān)于卷煙煙氣混合物中代表性危害成分和一些添加劑等的細(xì)胞活性檢測(cè)。朱茂祥研究員承擔(dān)的專(zhuān)項(xiàng)課題——卷煙煙氣安全性生物學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)，利用現(xiàn)代毒理學(xué)的原理和方法作為主要試驗(yàn)手段，把卷煙煙氣混合物中的全部化學(xué)物質(zhì)用劍橋?yàn)V片收集起來(lái)作為整體受試物，研制了卷煙煙氣動(dòng)物染毒裝置和卷煙體外毒理學(xué)主流煙氣暴露裝置，評(píng)價(jià)卷煙煙氣的急性和長(zhǎng)期毒性、致突變能力、致畸畸變能力和致癌作用，以及其他毒理學(xué)試驗(yàn)[7]。

2.3 實(shí)驗(yàn)室煙草毒理學(xué)試驗(yàn)技術(shù)進(jìn)展

實(shí)驗(yàn)室成立于2010年3月，以學(xué)院食品安全研究工作為基礎(chǔ)，結(jié)合煙草制品安全性評(píng)價(jià)的需要，整合資源，隨省局共建煙草工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的成立而逐步發(fā)展和完善，建有裝備齊全的細(xì)胞培養(yǎng)室，主要利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)開(kāi)展研究，預(yù)期建立體內(nèi)體外相結(jié)合的毒理學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)體系。目前已完成的試驗(yàn)成果主要有：4種煙草重金屬離子通道蛋白轉(zhuǎn)錄組的分析及應(yīng)用研究，建立了小白鼠活體毒理學(xué)評(píng)價(jià)模型，建立了全煙氣及煙草特有亞硝胺動(dòng)物毒理模型[8]，建立了全煙氣致小鼠肺損傷模型[9]，研究了NNK對(duì)V79和NCTC 1469 2種細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

3 煙用添加劑安全性評(píng)價(jià)技術(shù)前景與展望

目前，香精香料的使用與否主要看其燃吸時(shí)對(duì)香氣質(zhì)和香氣量的貢獻(xiàn)，較少考慮其毒理學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)于煙用添加劑的安全性標(biāo)準(zhǔn)，世界范圍內(nèi)也還沒(méi)有統(tǒng)一的準(zhǔn)則與規(guī)定。但是，煙用香精香料在煙草制品中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，而且煙用添加劑種類(lèi)繁雜，含量指標(biāo)不具備可視性，加入煙草制品后對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量影響不好預(yù)測(cè)。因此，進(jìn)行香精香料的毒理學(xué)研究試驗(yàn)對(duì)于合理使用煙用香精香料具有深遠(yuǎn)意義。在吸煙與健康這兩者矛盾之間找到適當(dāng)?shù)钠胶恻c(diǎn)不僅僅是煙草毒理學(xué)研究的重大目標(biāo)，對(duì)于煙草工業(yè)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展也關(guān)系密切。

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)市場(chǎng)對(duì)外開(kāi)放程度的增加，外國(guó)煙草公司必將更加廣泛地參與到煙草行業(yè)中來(lái)，民族卷煙工業(yè)面臨的競(jìng)爭(zhēng)將更趨激烈。進(jìn)行煙草毒理學(xué)研究，明確煙氣危害成分和毒理機(jī)理，開(kāi)發(fā)新型低危害高香氣卷煙制品，提高中式卷煙品牌價(jià)值，進(jìn)而在激烈的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中獨(dú)占鰲頭。

[1]吳維佳.煙用香精香料對(duì)卷煙安全性的影響 [D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[2]吳維佳.煙用香精香料的細(xì)胞毒性研究 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（9）：91-93，98.

[3]Hoffmann D，Djordjevic M V，Rivenson A，et al.Relative potencies of tobacco-specific N-nitrosamines as inducers of lung tumours in A/J mice[J].Cancer letters，1993 （1）：25-30.

[4]朱茂祥.中式低危害卷煙的毒理學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù) [G]//中式卷煙理論內(nèi)涵討論論文匯編.北京：國(guó)家煙草專(zhuān)賣(mài)局科技教育司，2004.

[5]Clements J.Study design consideration for in vitro toxicity assays on ingredients[G]//煙草制品及卷煙添加劑安全評(píng)價(jià)與低潛在性危害卷煙產(chǎn)品開(kāi)發(fā)國(guó)際研討會(huì)會(huì)刊.杭州：國(guó)家煙草專(zhuān)賣(mài)局，2004.

[6]聶聰.卷煙安全性評(píng)價(jià)體系的建立（2） [J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2011（4）：102，

[7]王永超，賈夢(mèng)珠，程生博，等.煙草石油醚含量研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2017（6）：51-52，55.

[8]寧維.全煙氣及煙草特有亞硝胺在小鼠中的安全性研究 [D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[9]寧維，陳利平，李瑜，等.全煙氣致小鼠肺損傷模型的建立 [J].煙草科技，2013（11）：36-40.◇