4-硝基苯胺降解菌的篩選及其代謝物研究

華益?zhèn)? 彭世文 凌敏

摘要? ? 為解決4-硝基苯胺（4-NA）難以降解的難題，本研究采用梯度馴化法分離篩選到一種對(duì)4-硝基苯胺具有較高耐受能力的細(xì)菌HY18，其10 mL LB發(fā)酵液48 h對(duì)100 mL濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液的去除率可達(dá)69.88%。通過(guò)形態(tài)觀察和16S rDNA測(cè)序試驗(yàn)，細(xì)菌HY18被鑒定為蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）。選取大腸桿菌作為指示微生物以及綠豆作為指示植物，對(duì)中間產(chǎn)物進(jìn)行毒性分析。結(jié)果表明，該生物降解過(guò)程低毒無(wú)害，與環(huán)境相容性好。本研究篩選的降解菌HY18可以為4-硝基苯胺污染修復(fù)提供有效解決方案。

關(guān)鍵詞? ? 4-硝基苯胺;生物降解;中間產(chǎn)物;代謝途徑;毒性分析

中圖分類(lèi)號(hào)? ? X53? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A? ? ? ? 文章編號(hào)? ?1007-5739（2018）23-0181-03

硝基苯類(lèi)物質(zhì)在農(nóng)藥、炸藥、染料、聚合物及香料等化工生產(chǎn)中廣泛使用，使該類(lèi)物質(zhì)在環(huán)境中不斷積累，污染危害嚴(yán)重。我國(guó)把苯胺類(lèi)化合物列入環(huán)境中的重點(diǎn)污染物，最高容許排放濃度為5 mg/L[1]。硝基苯類(lèi)物質(zhì)中4-硝基苯胺（4-NA）是一種重要的化工原料，其使用量大，也是常見(jiàn)的工業(yè)排放物，被國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局規(guī)定為優(yōu)先控制污染物[2]。4-硝基苯胺可通過(guò)呼吸和消化途徑進(jìn)入人體，促使氧與血紅蛋白結(jié)合變?yōu)楦哞F血紅蛋白，影響供氧而造成窒息，且對(duì)人體有很強(qiáng)的致癌性[3]。4-硝基苯胺毒性大、降解處理困難，國(guó)內(nèi)研究較少，至今絕大多數(shù)采用物理、化學(xué)法進(jìn)行處理，但這些方法費(fèi)用偏高，且操作要求較為嚴(yán)格，因而在生物降解方面研究較少[4-9]。因此，研究4-硝基苯胺的生物降解，對(duì)保護(hù)環(huán)境和人類(lèi)健康具有重要意義。本研究從4-硝基苯胺污染的土壤中篩選到具有對(duì)4-硝基苯胺生物降解能力的功能微生物蒼白桿菌屬（Ochrobactrum sp.）菌株HY18，并對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行了毒性檢驗(yàn)分析、鑒定并推測(cè)4-硝基苯胺的生物降解路徑。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試土樣

土壤樣品采自長(zhǎng)期受4-硝基苯胺污染的土地。用滅菌土鉆鉆取水稻田5～20 cm土壤2 kg，混勻后分裝于無(wú)菌密封袋，放于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃保存。

1.2? ? 培養(yǎng)基配方

1.2.1? ? 富集培養(yǎng)基。4-硝基苯胺5 mg/L，葡萄糖15 g/L，KH2PO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 4.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2.2? ? LB培養(yǎng)基。蛋白胨10.0 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g/L，pH值7.0～7.2。

1.2.3? ? 篩選培養(yǎng)基。4-硝基苯胺5 mg/L，葡萄糖15 g/L，NaCl 5 g/L，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 4-硝基苯胺降解菌的篩選與鑒定。采用搖瓶富集培養(yǎng)：取土壤樣品各10 g溶于100 mL無(wú)菌去離子水中，磁力攪拌30 min制備土壤懸浮液。取土壤懸浮液1 mL接種于100 mL濃度為5 mg/L的4-硝基苯胺的富集培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中在37 ℃、150 r/min條件下富集培養(yǎng)3 d。取1 mL細(xì)菌富集液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)?00 μL稀釋液涂布于4-硝基苯胺濃度為5 mg/L的篩選平板培養(yǎng)基上;于37 ℃培養(yǎng)3 d后，將生長(zhǎng)良好的菌落繼續(xù)依次轉(zhuǎn)接至濃度為10、20、40 mg/L的篩選平板培養(yǎng)基上;于37 ℃培養(yǎng)3 d后，選取在濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺篩選平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況最好的細(xì)菌為4-硝基苯胺耐受菌。將篩選到的菌株轉(zhuǎn)接于LB平板上，進(jìn)行劃線分離純化，接種于LB液體培養(yǎng)基發(fā)酵，用40%甘油于-70 ℃保存。

4-硝基苯胺的含量采用高效液相色譜來(lái)檢測(cè)，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10-12]，并進(jìn)行了改進(jìn)。檢測(cè)條件：高效液相色譜儀為Agilent 1260;檢測(cè)器為2498紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm;色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm× 150 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇∶水=60∶40（體積比），流速為0.8 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;柱溫為37 ℃。

無(wú)菌條件下，挑取4 ℃保存于斜面上的4-硝基苯胺耐受菌菌株，接種于無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)8～10 h制成種子液;將種子液按2%的比例接種于不含4-硝基苯胺的富集培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，得到耐受菌發(fā)酵液。配制濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，將10 mL耐受菌發(fā)酵液接種至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒溫?fù)u床中以120 r/min振蕩培養(yǎng)，3 d后將搖瓶中溶液定容至100 mL測(cè)定耐受菌對(duì)4-硝基苯胺的降解率。選擇降解能力最大的耐受菌為最終降解菌，并進(jìn)行菌種鑒定[13]。

配制濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，將10 mL降解菌發(fā)酵液接種至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速120 r/min），測(cè)定隨時(shí)間變化4-硝基苯胺濃度的變化，繪制降解曲線，測(cè)定時(shí)間分別為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0、36.0、48.0、60.0 h。

16S rDNA基因序列分析：以提取菌株的基因組為模板，用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，參照天根生化科技有限公司的DNA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，純化后的產(chǎn)物測(cè)序由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司的ABI 3730XL自動(dòng)測(cè)序儀完成。所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，利用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株的種屬[13]。

1.3.2? ? 降解物的毒性分析。測(cè)定4-硝基苯胺及其代謝物的毒性，測(cè)定其抑制效果[14-16]。選取大腸桿菌（Escherichia coli）作為指示微生物，測(cè)定4-硝基苯胺及其代謝物的毒性。將大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基中，于30 ℃搖床培養(yǎng)24 h。取25 mL發(fā)酵液分別加入25 mL濃度為50、100 mg/L的4-硝基苯胺或其代謝物，使4-硝基苯胺或其代謝物的最終濃度分別為25、50 mg/L。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組加蒸餾水。24 h后通過(guò)梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定大腸桿菌活細(xì)胞數(shù)，通過(guò)與對(duì)照組對(duì)比計(jì)算大腸桿菌抑制率。

選取綠豆作為指示植物，測(cè)定4-硝基苯胺及其代謝物的毒性。在濕潤(rùn)的定性濾紙上種植20粒種子，待種子發(fā)芽露白后分別滴加10 mL濃度為25、50 mg/L的4-硝基苯胺或其代謝物。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，對(duì)照組加蒸餾水，放置于人工氣候箱培養(yǎng)4 d，觀察不同組分對(duì)綠豆幼苗的生長(zhǎng)狀況，測(cè)定記錄其苗長(zhǎng)，計(jì)算平均值。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 4-硝基苯胺降解菌的篩選

從4-硝基苯胺污染的土壤中取樣，通過(guò)搖瓶富集培養(yǎng)、不同4-硝基苯胺濃度篩選培養(yǎng)基梯度篩選的方法獲得4-硝基苯胺耐受菌。測(cè)定耐受菌是否對(duì)4-硝基苯胺有降解能力，選擇降解率最大的耐受菌為降解菌。

采取4-硝基苯胺濃度梯度馴化法，初篩結(jié)果如表1所示，從濃度為5 mg/L的4-硝基苯胺的LB平板上篩選到不同的菌落共計(jì)22個(gè)。繼續(xù)轉(zhuǎn)接至10、20 mg/L等濃度的LB平板上，其中大部分菌落耐性逐漸減弱，剩下7個(gè)仍表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)情況。直至轉(zhuǎn)接于40 mg/L培養(yǎng)基，僅剩下3個(gè)菌落仍具有較強(qiáng)4-硝基苯胺耐受性。從中選出生長(zhǎng)情況較好的菌株HY8、HY16、HY18作為進(jìn)一步研究的供試菌種，測(cè)定其對(duì)4-硝基苯胺的降解率。

配制濃度為40 mg/L的4-硝基苯胺溶液，10 mL耐受菌HY8、HY16、HY18發(fā)酵液接種至100 mL 4-硝基苯胺溶液中，在恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速120 r/min）。3 d后將搖瓶中溶液定容至100 mL，測(cè)定耐受菌對(duì)4-硝基苯胺降解率，結(jié)果如圖1所示。耐受菌HY8、HY16、HY18降解3 d后對(duì)4-硝基苯胺降解率分別為43.57%、35.8%、68.62%，選擇降解能力最強(qiáng)的耐受菌HY18為最終降解菌。

通過(guò)接種降解菌HY18，4-硝基苯胺被降解為次生代謝物，此生物降解過(guò)程釋放的能量被轉(zhuǎn)化為ATP供蒼白桿菌HY18存活和生長(zhǎng)繁殖;4-硝基苯胺的一部分C和N元素被HY18吸收用于組成其細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)。剛接種時(shí)，4-NA溶液中降解菌菌數(shù)最大，但由于細(xì)菌對(duì)環(huán)境需要一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，故在0～2 h內(nèi)，細(xì)菌對(duì)4-NA降解率較低，2 h降解率為3.9%;此后，細(xì)菌HY18降解4-硝基苯胺速率加快，8 h降解率達(dá)21.1%，24 h時(shí)降解率達(dá)61.06%;此后，由于營(yíng)養(yǎng)匱乏，細(xì)菌細(xì)胞逐漸死亡，降解速度下降，36 h降解率為65.49%;48 h對(duì)4-NA的降解率達(dá)到最高值，為69.88%（圖2）。

通過(guò)接種HY18，4-硝基苯胺能夠很好地被降解。由于降解試驗(yàn)設(shè)置4-硝基苯胺濃度為40 mg/L，用10 mL降解菌發(fā)酵液降解100 mL不含其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的4-硝基苯胺溶液，則4-硝基苯胺48 h降解率仍然達(dá)69.88%。由此可見(jiàn)，HY18對(duì)4-硝基苯胺具有比較好的生物降解效果，是一種應(yīng)用前景較好的微生物。若在4-硝基苯胺溶液中添加如葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，降解菌HY18可以繼續(xù)生長(zhǎng)，其對(duì)4-硝基苯胺的降解率將會(huì)更高。

2.2? ? 4-硝基苯胺降解菌的鑒定

HY18接種在LB平板培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)3 d后，菌落濕潤(rùn)帶淺黃色，邊緣整齊光滑且顏色較中間稍淺，有光澤，中間稍稍隆起，革蘭氏染色試驗(yàn)結(jié)果為陰性。在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌無(wú)芽孢形成，呈細(xì)桿狀。

將菌株HY18的16S rDNA基因序列與GenBank的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（Blast），菌株HY18同Ochrobactrum sp.（KF987808）的相似度達(dá)到99%。使用軟件Mega 4.0以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3所示，并結(jié)合各菌株菌落形態(tài)特征，菌株HY18被鑒定為蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）。

2.3? ? 降解產(chǎn)物毒性分析

由圖4可以看出，4-硝基苯胺對(duì)大腸桿菌和綠豆2種指示生物都有較強(qiáng)的抑制作用，而4-硝基苯胺代謝物對(duì)大腸桿菌和綠豆的毒性較低。

大腸桿菌接種至4-硝基苯胺溶液中細(xì)胞死亡數(shù)較高，25、50 mg/L的4-硝基苯胺對(duì)大腸桿菌的抑制率分別高達(dá)81.4%、87.4%。而4-硝基苯胺代謝物對(duì)大腸桿菌抑制率較低，分別為19.2%、32.7%。

在蒸餾水對(duì)照組的影響下，對(duì)照組綠豆苗長(zhǎng)的平均值為5.4 cm;滴加25、50 mg/L的4-硝基苯胺后，綠豆生長(zhǎng)受到抑制，苗長(zhǎng)分別2.3、1.9 cm;滴加25、50 mg/L的4-硝基苯胺代謝物對(duì)綠豆生長(zhǎng)抑制作用則比較弱，苗長(zhǎng)分別達(dá)4.7、3.6 cm。

由上述結(jié)果可知，4-硝基苯胺對(duì)大腸桿菌及綠豆有巨大的毒害作用，通過(guò)蒼白桿菌HY18的降解后，大部分4-硝基苯胺被利用，其代謝物對(duì)2種指示生物的抑制作用較低。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)篩選出的降解菌對(duì)4-硝基苯胺進(jìn)行降解，含有4-硝基苯胺的溶液生物毒性明顯降低。

3? ? 結(jié)論與討論

本研究篩選獲得了能夠?qū)?-硝基苯胺進(jìn)行生物降解的功能菌蒼白桿菌HY18（Ochrobactrum sp.），此前蒼白桿菌僅在間苯氧基苯甲醛降解上有報(bào)道，未見(jiàn)對(duì)4-硝基苯胺有生物降解能力方面的報(bào)道;研究了HY18的生長(zhǎng)降解曲線，證實(shí)了其對(duì)4-硝基苯胺具有比較好的生物降解效果，其LB培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)4-硝基苯胺的去除率可達(dá)69.88%;毒性分析試驗(yàn)結(jié)果顯示，4-硝基苯胺降解代謝物低毒無(wú)害。以上結(jié)果表明，降解菌HY18具有解決土壤中4-硝基苯胺污染問(wèn)題的巨大潛能。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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