獸用疫苗生產(chǎn)中支原體的檢測方法

王淑梅

（黑龍江省拜泉縣三道鎮(zhèn)畜牧綜合站，黑龍江 拜泉 164700）

獸用生物制品使用的生產(chǎn)中培養(yǎng)細(xì)胞，如果被支原體污染，則會對制品的質(zhì)量和安全性造成比較大的負(fù)面影響，同時(shí)會在經(jīng)濟(jì)方面造成比較嚴(yán)重的損失。所以，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)該掌握對支原體污染的檢測方法，及相關(guān)的衍生技術(shù)確保獸用生物制品的質(zhì)量與安全。

目前，已知自然界中存在的類微生物遠(yuǎn)超過100種，而這些微生物都會直接或間接對人類和動物造成感染。

據(jù)相關(guān)的試驗(yàn)結(jié)果可知，支原體對國內(nèi)采用的普通疫苗和細(xì)胞生產(chǎn)活毒疫苗造成了比較嚴(yán)重的污染，給生物制藥企業(yè)造成非常大的經(jīng)濟(jì)壓力，同時(shí)也不利于畜禽疾病防控工作的順利開展。相關(guān)規(guī)定中注明所有細(xì)胞生產(chǎn)的活疫苗不檢測到支原體，所以就要求相關(guān)的技術(shù)人員熟練掌握支原體的檢測技術(shù)，以保證生物制品生產(chǎn)工作順利開展。

1 支原體的檢測

1.1 傳統(tǒng)檢測法

（1）直接培養(yǎng)法：我國的相關(guān)準(zhǔn)則中明確規(guī)定，直接培養(yǎng)法是支原體檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。主要是將待檢樣品接種到支原體培養(yǎng)基上，對液體培養(yǎng)基的顏色和固體培養(yǎng)基上支原體菌落的變化進(jìn)行觀察，然后通過正確的判斷給出試驗(yàn)結(jié)果，這種方法的準(zhǔn)確率比較高，但是培養(yǎng)的時(shí)間卻比較長，同一個(gè)培養(yǎng)基中所有的支原體類型并不能全部的檢測出來，所以這種檢測方法一般應(yīng)用于種毒和成品的檢測。

（2）DNA熒光染色法：此種方法也被稱為指示細(xì)胞法，此種檢測方法的耗時(shí)比較短，能夠同時(shí)對多個(gè)樣品進(jìn)行檢測，對采用培養(yǎng)法不能檢測出的支原體給予正確的檢測，如果有條件在配制疫苗之前就進(jìn)行初步的檢測，將其中不合格的樣品去除掉，這樣既能避免相應(yīng)的損失，又能有效保證對疫苗的質(zhì)量。

1.2 血清學(xué)法

（1）被動顆粒凝集試驗(yàn)(PPA)：可應(yīng)用于細(xì)菌、支原體的鑒定和抗體的定性檢測。我國相關(guān)的專家用此方式對肺炎支原體進(jìn)行檢測，結(jié)果可知被動凝集法的操作比較簡單，但是卻具有比較高的精確性和敏感度，在實(shí)際的臨床生產(chǎn)中可以更有效的應(yīng)用。

（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：醫(yī)學(xué)界至今為止，用此種方法是診斷人和動物肺炎支原體實(shí)用和可靠的方法之一。本檢測方法操作簡單并且特異性和敏感性都比較佳，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并且成為檢測肺炎支原體的在臨床中的常規(guī)方法。

1.3 分子生物學(xué)技術(shù)

（1）PCR檢測技術(shù)：支原體通常生長都比較緩慢并且對營養(yǎng)環(huán)境的要求相對比較高，并且在種間存在交叉抗原等生物學(xué)特性。隨著相關(guān)領(lǐng)域研究人員逐漸深入對支原體的核酸結(jié)構(gòu)、分子組成及其特異性的了解，國際上就已經(jīng)在支原體的檢測中融入了PCR技術(shù)技術(shù)，在特異性和靈敏性方面有更佳的表現(xiàn)，并且在獸用生物制品的生產(chǎn)中進(jìn)行了廣泛的推廣和應(yīng)用，但是此種方法對試驗(yàn)環(huán)境和儀器的要求標(biāo)準(zhǔn)相對比較高，所以很容易出現(xiàn)交叉污染的情況，生產(chǎn)中必須給予足夠的重視。

（2）巢式PCR檢測法：基于PCR檢測方法加以優(yōu)化改進(jìn)，主要是通過設(shè)計(jì)巢式PCR引物的方式，根據(jù)擴(kuò)增后是否存在目的片段的情況對具體的污染狀況加以比較合理且正確的判斷，然后還要再根據(jù)存在片段的大小情況，對污染的支原體類型進(jìn)行正確的判斷分析，從而將污染源進(jìn)行準(zhǔn)確的判斷。

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：最初是早在1996年的美國某家公司第一次推出了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測技術(shù)?，F(xiàn)在，在動物營養(yǎng)與繁殖、動物遺傳育種及動物疾病檢測和預(yù)防等領(lǐng)域已經(jīng)都有了實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，但是在實(shí)際的應(yīng)用中，在應(yīng)用方面沒有達(dá)到特別廣泛的范圍，從而受到了一定的限制，應(yīng)用時(shí)應(yīng)該給予一定的重視。

（4）DNA分子雜交檢查法：原核生物的rRNA是高度保守的。采用這種檢測方法具有特異性高的特點(diǎn)，可大致的鑒別出污染支原體的種類。

2 相關(guān)的防治

目前已知自然界中有多于120種的支原體存在，在生物制品生產(chǎn)中，感染支原體的組織細(xì)胞會在不同程度上改變細(xì)胞形態(tài)和遺傳物質(zhì)，從而對病毒的復(fù)制過程產(chǎn)生一定的影響，同時(shí)會在不同程度上改變宿主細(xì)胞的免疫能力，從而誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。所以在獸用疫苗生產(chǎn)過程中，尤其是將培養(yǎng)細(xì)胞作為材料的疫苗生產(chǎn)情況，應(yīng)該對支原體的預(yù)防加以重視，決不能忽視。保持細(xì)胞營養(yǎng)液呈酸性，可以抑制支原體的生長，避免支原體污染。目前在我國獸用疫苗的生產(chǎn)中技術(shù)人員檢測支原體的存在和鑒定支原體的種類，以便有針對性地切斷支原體污染。