基因可變剪接的調(diào)控機(jī)制及其研究進(jìn)展

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(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 陜西 楊凌 712100；2.貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院畢節(jié)試驗(yàn)區(qū)研究院, 貴州 畢節(jié) 551700；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 陜西 楊凌 712100)

0 引言

早在19世紀(jì)80年代就有關(guān)于基因可變剪接的記錄[1]，而隨著測(cè)序技術(shù)的成熟，越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)行可變剪接，這使得人們不得不重新認(rèn)識(shí)基因的表達(dá)的蛋白質(zhì)的多樣性的關(guān)聯(lián)。隨著越來(lái)越多的生物物種中可變剪接被發(fā)現(xiàn)，它的作用也越來(lái)越重要，弄清它的調(diào)控機(jī)制成了至關(guān)重要的一步，這也是對(duì)可變剪接進(jìn)行利用的前提。研究發(fā)現(xiàn)順式作用元件（Cisacting element）和反式作用因子（Trans-acting element）的相互作用調(diào)控著可變剪接的發(fā)生，而隨著研究的深入，越來(lái)越多的因素被牽扯其中。

1 基因可變剪接定義及其類型

1.1 基因可變剪接定義

可變剪接是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的一種重要機(jī)制，它是指由一個(gè)共同的RNA前體在剪接體和其他剪接因子的作用下，通過(guò)不同的剪接位點(diǎn)產(chǎn)生不同的成熟RNA的過(guò)程?；虻目勺兗艚迂S富了基因的表達(dá)產(chǎn)物，每個(gè)剪接后成熟的RNA在特定的時(shí)期、特定的組織器官中表達(dá)并發(fā)揮其功能，這對(duì)于生物體個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞的一系列生理過(guò)程有著重要意義，同時(shí)可變剪接對(duì)于蛋白質(zhì)的多樣化和時(shí)空的基因表達(dá)調(diào)控都具有重要意義[2-3]。

1.2 基因可變剪接類型

可變剪接在植物和動(dòng)物細(xì)胞中都有發(fā)生，剪接的方式也比較豐富，目前主要的方式有以下幾種：內(nèi)含子保留(Intron retention)，主要發(fā)生在植物細(xì)胞中；外顯子跳躍(Skipped exon )，這種方式主要在動(dòng)物細(xì)胞中有所發(fā)現(xiàn)；5’末端可變剪切和3’末端可變剪切(Alternative donor；Alternative acceptor)，互斥外顯子剪切(Mutually exclusive exons)等等，在一次可變剪接中，這些方式有時(shí)并不是單獨(dú)發(fā)生，而是幾種方式的組合，經(jīng)過(guò)這些不同的剪接方式的組合可以產(chǎn)生多種具有不同功能的成熟RNA。

2 基因可變剪接的調(diào)控機(jī)制

2.1 剪接體的組成及對(duì)前體RNA的加工過(guò)程

剪接體是由5個(gè)小核糖核蛋白復(fù)合體（snRNAs）U1，U2，U4，U5和U6和50～100種左右非snRNP蛋白組成的一種復(fù)合體。它的形成過(guò)程是U1和蛋白質(zhì)相互作用形成一個(gè)復(fù)合體，然后再結(jié)合U2形成剪接體的前體，最后結(jié)合上U4、U5和U6就形成了剪接體[4]。前體RNA的剪接過(guò)程包括剪接體的組裝、緊連在一起的兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)以及內(nèi)含子的降解構(gòu)成。組裝好的剪接體在分支位點(diǎn)處的腺苷酸羥基發(fā)生親核攻擊，使剪接位點(diǎn)的磷酸二酯鍵斷裂從而形成兩個(gè)剪接的中間體，一個(gè)是5’外顯子，一個(gè)是包含內(nèi)含子和3’外顯子的套索狀分子，然后前一種中間體攻擊套索狀分子，使其中的內(nèi)含子被去除并降解，進(jìn)而將兩個(gè)外顯子連接起來(lái)，完成剪接過(guò)程[4]。

2.2 順式作用元件和反式作用因子的調(diào)控作用

在前體RNA上存在著特異性的順式作用元件序列，如果能增強(qiáng)剪接的發(fā)生，則稱為剪接增強(qiáng)子（Splicing enhancer），反之則稱為剪接沉默子（Splicing silencer)，由于它既可以存在于外顯子中，亦可存在于內(nèi)含子中，所以將它們細(xì)分為外顯子剪接增強(qiáng)子和沉默子（Exonic splicing enhancers，ESEs；Exonic splicing silencer，ESSs），內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子和沉默子（Intronic splicing enhancers,ISEs；Intronic splicing silencer,ESSs）。反式作用因子是一類可以和順式作用元件發(fā)生特異性的結(jié)合來(lái)調(diào)控剪接發(fā)生的強(qiáng)度的蛋白質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的主要有SR蛋白質(zhì)家族和hnRNP蛋白質(zhì)家族以及一些特異性因子。

2.2.1 SR蛋白的調(diào)控作用

SR蛋白是一類富含絲氨酸（S）和精氨酸（R）的剪接因子，它包括氨基末端的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RNA Binding Domain,RBD)和位于羧基末端的RS結(jié)構(gòu)域（RS domain），目前發(fā)現(xiàn)的SR蛋白有SC35、SF2/ASF、SRp20、SRp30等。SR蛋白識(shí)別特異的前體mRNA并與之結(jié)合的能力取決于它的RBD，RS結(jié)構(gòu)域則通過(guò)自身的磷酸化參與了SR蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位以及SR蛋白之間或與其他因子之間的相互作用[5]。SR蛋白通過(guò)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與前體RNA特異性序列結(jié)合來(lái)協(xié)助其它的剪接因子與剪接位點(diǎn)的正確結(jié)合[6]。

2.2.2 hnRNP蛋白質(zhì)家族的調(diào)控作用

hnRNP又稱解鏈蛋白，目前，發(fā)現(xiàn)了A1、A2/B1和D0等家族成員,它們通常也含有不止一個(gè)的RBD,其中A1是在真核生物細(xì)胞中存在較為豐富的一種，它能通過(guò)自身含有的多個(gè)RBD與前體RNA特異性結(jié)合形成復(fù)合物，然后在SR蛋白的幫助在以球狀調(diào)節(jié)因子的形式來(lái)完成選擇性的跨過(guò)外顯子，實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)基因的可變剪接的功能[7-8]。

2.2.3 KH-domain剪接因子的調(diào)控作用

KH-domain也是一種蛋白質(zhì)家族，包括了能與高密度脂蛋白(HDL)結(jié)合的vigilin等，目前研究較為透徹的KH-domain剪接因子為FMR1(fragile X mental retardation 1)，它含有2個(gè)KH結(jié)構(gòu)域，在人類的脆性X染色體綜合征的發(fā)生中起作用，它依靠自身α螺旋和β折疊形成的loop結(jié)構(gòu)來(lái)識(shí)別單鏈的RNA，參與RNA 的可變剪接[9]。

2.3 RNA對(duì)可變剪接的調(diào)控作用

2.3.1 內(nèi)含子序列的調(diào)控

有很多內(nèi)含子和外顯子的剪接是由內(nèi)含子RNA序列催化的，根據(jù)剪接機(jī)制的差異，可以將這些內(nèi)含子分為I型內(nèi)含子、II型內(nèi)含子、核mRNA內(nèi)含子以及tRNA內(nèi)含子[10]，其中前3種內(nèi)含子的剪接反應(yīng)是跟RNA的結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)的， 特別的I型內(nèi)含子和II型內(nèi)含子的剪接是自身催化調(diào)控的，所以它們又稱為核酶。

I型內(nèi)含子催化的前體RNA內(nèi)含子的切除和外顯子的連接是通過(guò)兩步連續(xù)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，第一步是識(shí)別剪接位點(diǎn)，第二步反應(yīng)在鎂離子的協(xié)助下導(dǎo)致內(nèi)含子被剪除并將外顯子連接起來(lái)[11]。

II型內(nèi)含子和核mRNA內(nèi)含子的剪接反應(yīng)也是通過(guò)兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)完成的，其中核mRNA內(nèi)含子的兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是由剪接體完成的，通過(guò)U1、U2、U4、U5和U6的一系列反應(yīng)來(lái)達(dá)到釋放內(nèi)含子和連接外顯子的目的[11]。

2.3.2 長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNAs）的調(diào)控作用

lncRNAs屬于非編碼RNA的一種，研究發(fā)現(xiàn)它可以和SR蛋白相互作用來(lái)參與可變剪接的調(diào)控，它會(huì)影響SR蛋白的磷酸化位點(diǎn)，同時(shí)它也可以為特定的剪接因子提供結(jié)合位點(diǎn)，從而有利于可變剪接的進(jìn)行[12]。

2.4 snRNP的調(diào)控作用

snRNPs中與前體RNA剪接有關(guān)的有U1、U2、U4、U5和U6等，其中U1A的結(jié)構(gòu)研究的較為透徹,它可以通過(guò)自身的RBD識(shí)別RNA形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)并與之相結(jié)合而形成復(fù)合物，這種識(shí)別具有序列特異性和空間立體化學(xué)特異性。另一種比較重要的snRNP是進(jìn)化上有很強(qiáng)保守性的U5，這種特異性的蛋白在分子結(jié)構(gòu)上的某些改變可以為其他剪接因子和RNA提供結(jié)合位點(diǎn)，可以和其他剪接因子形剪接復(fù)合物，在前體RNA的可變剪接中發(fā)揮重要作用[13]。

2.5 核小體定位對(duì)剪接作用的影響

一定長(zhǎng)度的特定DNA片段在組蛋白八聚體上的纏繞方式就被稱為核小體定位，它保證了龐大的基因組能夠儲(chǔ)存在空間有限的細(xì)胞內(nèi)，并且在復(fù)制，轉(zhuǎn)錄等生物活動(dòng)中起到重要作用。研究表明，外顯子附近的DNA序列更傾向于形成核小體而內(nèi)含子以及剪接位點(diǎn)附近則排斥核小體的形成，顯然核小體因?yàn)槠湎鄬?duì)致密的結(jié)構(gòu)不利于剪接的發(fā)生，所以排斥核小體形成對(duì)該區(qū)域剪接復(fù)合體的形成更為有利，通過(guò)這種方式可以抑制或增強(qiáng)剪接的發(fā)生[14]。

2.6 表觀遺傳方面對(duì)剪接的調(diào)控

表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化而基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳變化的現(xiàn)象，而其中所涉及的DNA甲基化和組蛋白修飾可能與基因的可變剪接的調(diào)控有一定關(guān)聯(lián)。DNA的甲基化的程度在外顯子和內(nèi)含子區(qū)域是不同的，這可能影響基因的可變剪接。有研究表明可以通過(guò)特定的組蛋白修飾來(lái)募集剪接因子從而改變RNA聚合酶的延伸速率進(jìn)而調(diào)控可變剪接[15]。

2.7 基因突變對(duì)可變剪接的調(diào)控

基因突變可以改變可變剪接的順式作用元件的結(jié)構(gòu)，從而影響剪接因子與它的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的可變剪接。突變導(dǎo)致影響可變剪接的類型有以下幾種[16]：核心調(diào)控元件缺失，像內(nèi)含子開(kāi)頭的GT和結(jié)尾的AG這些堿基若發(fā)生變化則會(huì)導(dǎo)致內(nèi)含子保留或者外顯子跳躍這2種類型的剪接；產(chǎn)生新的接頭序列，這會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)新的剪接位點(diǎn)而使RNA剪接發(fā)生錯(cuò)誤；剪接的調(diào)控序列的改變，如增強(qiáng)子和沉默子，一旦它們發(fā)生改變，剪接的效率會(huì)受到影響。

另外基因的可變剪接和基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程是緊密聯(lián)系在一起的，影響基基因轉(zhuǎn)錄的因素很多也都會(huì)波及到基因的可變剪接，所以在可變剪接的調(diào)控方面依然有很多需要去繼續(xù)研究。

3 可變剪接在不同生物中的研究

3.1 豬

豬的脂肪與肥胖相關(guān)基因（Fat mass and obesity associated，F(xiàn)TO)與豬的肌內(nèi)脂肪（ Intramuscular fat ,IMF）含量呈現(xiàn)出顯著相關(guān)，而肌內(nèi)脂肪是評(píng)價(jià)豬肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，它反映了肉的口感和多汁性[17]，因此研究FTO基因的可變剪接具有實(shí)際的經(jīng)濟(jì)意義。黃的團(tuán)隊(duì)[18]通過(guò)對(duì)藏豬和大白豬的閹割和非閹割公豬FTO基因的研究，在它們的腹脂和背膘中發(fā)現(xiàn)了4種新的FTO可變剪接形式。

組織蛋白酶B（Cathepsin B,CTSB）對(duì)肌肉中的蛋白質(zhì)有廣泛的水解作用，產(chǎn)生小的多肽和游離的氨基酸，調(diào)節(jié)肉制品尤其是腌制火腿的風(fēng)味[19]。陳等[20]人通過(guò)豬的EST序列分析發(fā)現(xiàn)了CTSB基因的新的剪接變異體CTSB2，并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR和序列分析等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。

這2個(gè)基因的可變形式的發(fā)現(xiàn)，就可以通過(guò)對(duì)FTO基因的表達(dá)調(diào)控來(lái)有目的地創(chuàng)造肉質(zhì)更為鮮美，口感更為優(yōu)越的肉豬個(gè)體作為優(yōu)良的種畜進(jìn)行使用，從而有利于肉豬品種的改良。

3.2 羊

脂肪細(xì)胞的研究不僅在人的肥胖癥中有重要意義，在畜牧生產(chǎn)中的作用同樣也不可忽略，如提高胴體的瘦肉率和增加IMF含量，而這其中對(duì)脂肪細(xì)胞中的基因可變剪接的研究顯得尤為重要。杜等[21]通過(guò)對(duì)絨山羊的肌內(nèi)脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNASeq）數(shù)據(jù)的研究，發(fā)現(xiàn)了除了互斥外顯子剪接的其他四種方式，這些發(fā)現(xiàn)為研究可變剪接的機(jī)制和生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。

綿羊促卵泡激素受體(Follicle stimulating hormone receptor FSHR)是特異性結(jié)合FSH從而調(diào)控個(gè)體繁殖功能的一種蛋白，由FSHR基因編碼。吳等[22]以綿羊卵泡顆粒細(xì)胞為材料,克隆 FSHR基因的cDNA片段,并測(cè)序分析該基因可變剪接體的種類及序列特征,鑒定出了FSHR基因的除了經(jīng)典的編碼695個(gè)氨基酸的以外的其它6種FSHR，但有趣的是，能表達(dá)出蛋白質(zhì)分子的只有經(jīng)典的FSHR剪接形式，至于其它剪接形式的生物學(xué)功能則有待研究。

可通過(guò)基因表達(dá)的調(diào)控，可以使其定向表達(dá)出特定形式，從而提高胴體的瘦肉率和增加肌間脂肪的含量，同時(shí)也可培育出繁殖性能更為優(yōu)越的綿羊品種，為綿羊的育種提供便利。

3.3 牛

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)淋巴細(xì)胞激活分子家族7（Signaling lymphocytic activation molecule family member7，SLAMFM7）具有調(diào)節(jié)自然殺傷力細(xì)胞((Natural killer cell，NK)的功能，SLAMFM7基因可能通過(guò)基因的可變剪接來(lái)在奶牛的乳腺炎的抗性反應(yīng)中發(fā)揮功能。鞠等[23]采樣健康和患有乳腺炎的奶牛組織，運(yùn)用RT-PCR以及測(cè)序技術(shù)進(jìn)行研究，通過(guò)序列比較在乳腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的可變剪接形式，它們編碼不同數(shù)目氨基酸的蛋白，本實(shí)驗(yàn)中的一種轉(zhuǎn)錄本在健康和患病乳腺細(xì)胞中的表達(dá)量與其它研究的結(jié)果不一致，可以推測(cè)出SLAMFM7基因的可變剪接具有乳腺炎病原菌特異性。

通過(guò)對(duì)牛不同組織的研究，利用電子克隆和PCR方法成功驗(yàn)證并發(fā)現(xiàn)了NFIX基因存在5種不同轉(zhuǎn)錄本，并且在不同組織中顯示出表達(dá)多樣化的差異，這說(shuō)明同一基因的不同亞型可能會(huì)具有不同功能[24]。他們還研究了3個(gè)脂肪沉積相關(guān)基因的可變剪接模式，發(fā)現(xiàn)3種基因的亞型在細(xì)胞中分布不同且有一定區(qū)域性，這顯示可變剪接可能影響基因在細(xì)胞質(zhì)中的分布。

牛的乳腺炎一直是產(chǎn)奶業(yè)中危害較大的一種疾病，通過(guò)對(duì)SLAMFM7基因的誘導(dǎo)調(diào)控，可以增強(qiáng)奶牛對(duì)于乳腺炎的抗性反應(yīng)，減少奶的損失，而NFIX基因可在脂肪的沉積上起作用，可通過(guò)調(diào)控表達(dá)，使得牛肉含有更多的肌間脂肪，增加其適口性。

3.4 鴨

鴨是一種重要的經(jīng)濟(jì)型水禽，同時(shí)也是實(shí)驗(yàn)研究的一種模式動(dòng)物。陳等[25]以北京鴨腹部的脂肪組織為材料，通過(guò)RNA-seq序列比較等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)了18464個(gè)基因中有15070個(gè)發(fā)生了35913次可變剪接，82%的可變剪接率低于人類的95%而高于果蠅的60%。

鴨肉的消費(fèi)也是禽類中重要的組成部分，而鴨肉的適口性決定了它的受歡迎程度，通過(guò)對(duì)鴨肉脂肪組織中基因的調(diào)控，可以使得鴨肉的肉質(zhì)更為符合目前消費(fèi)者的要求。

3.5 雞

Lipin1基因的表達(dá)顯著影響脂肪的沉積，它的正常表達(dá)、微表達(dá)和超表達(dá)都會(huì)引起脂肪沉積量的變化。王的團(tuán)隊(duì)[26]通過(guò)對(duì)烏雞的不同組織lipin1基因表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)了2種剪接形式：lipin1-α和lipin1-β。

雞肉中脂肪的含量顯著影響雞肉的品質(zhì)和口感，因此通過(guò)調(diào)控lipin1-α和lipin1-β2種形式的相對(duì)表達(dá)量可以生產(chǎn)出符合消費(fèi)者需求的雞肉產(chǎn)品。

4 展望

基因可變剪接連接著基因組與蛋白組，是基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，成為了功能基因組時(shí)代研究的重點(diǎn)之一。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄本和基因組進(jìn)行測(cè)序比較可以發(fā)現(xiàn)可變剪接的形式，但隨著研究的樣本越來(lái)越多，數(shù)據(jù)分析的量越來(lái)越大，高通量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展就顯得尤為重要，同時(shí)對(duì)于調(diào)控機(jī)制的研究要結(jié)合著其它生物過(guò)程以一個(gè)整體的思路來(lái)進(jìn)行。

在動(dòng)物的遺傳育種上，上面那些發(fā)現(xiàn)的基因的可變形式，有些類型可以促進(jìn)某種性狀的發(fā)生，而通過(guò)對(duì)基因可變剪接調(diào)控機(jī)制的使用，可以定向的剪接出人類生產(chǎn)需要的表達(dá)類型，這就為品種的改良提供了一條更為高效的方法。無(wú)論是在繁殖性能方面，還是生長(zhǎng)肥育方面，亦或是抗病力方面，都可以通過(guò)基因的可變剪接來(lái)提高相應(yīng)的經(jīng)濟(jì)性狀，使個(gè)體具備更為優(yōu)良的性狀，為品種的改良和提高奠定基礎(chǔ)。如何利用基因的可變剪接來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)從而提高畜產(chǎn)品的質(zhì)量和數(shù)量成為一個(gè)可行的方案。

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