PCV2 Cap蛋白的胞內(nèi)互作蛋白研究進展

陳 艷，顏 秋，劉 暢，呂其壯,2*

(1.玉林師范學(xué)院 生物與制藥學(xué)院，廣西 玉林 537000；2.廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，廣西 玉林 537000)

PCV2作為已知的感染哺乳動物的最小病毒[1]，不僅被確定為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原體[2]，而且能引起豬體繼發(fā)其他類型疾病的感染，使豬體發(fā)病狀況呈混合感染趨勢，對全球的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3-4]。目前，國內(nèi)外對PCV2的研究多數(shù)集中在PCV2新型基因工程疫苗的研發(fā)和PCV2感染的檢測方法方面，雖然已研制成功了多種類型的疫苗和先進的診斷方法，然而，在很多國家和地區(qū)PCV2依然是困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病病原體之一。究其原因是人們對PCV2的致病機理還不是十分清楚，尤其是PCV2導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)抑制的機理、PCV2與宿主細胞的相互關(guān)系、PCV2編碼的蛋白對PCV2復(fù)制和致病性的調(diào)控機制、與宿主細胞內(nèi)蛋白分子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)等方面的研究內(nèi)容相對較少。鑒于此，本文對PCV2唯一的結(jié)構(gòu)蛋白Cap的胞內(nèi)互作蛋白的研究進展進行全面闡述，以期為進一步開展PCV2 Cap蛋白在病毒的復(fù)制、運輸以及致病性中作用的研究提供依據(jù)。

1 Cap蛋白概述

Cap蛋白是PCV2病毒的衣殼蛋白，由位于PCV2單鏈閉合環(huán)狀DNA負義鏈上的ORF2基因編碼并由宿主所編碼的蛋白酶合成，全長234 aa，分子量約為27.8 kDa[3]。研究表明，Cap蛋白主要定位于宿主細胞核中，其N端的前41個aa是該蛋白的核定位信號(NLS)，其中第12～18位氨基酸殘基(R-H-R-P-R-S-H)和第34～41位氨基酸殘基(H-R-Y-R-W-R-R-K)對Cap蛋白的核定位起決定性作用[2-3,5]。分子生物學(xué)研究表明，Cap蛋白只有一個糖基化位點(143～145 aa)，其N端富含堿性氨基酸和精氨酸且是其主要抗原位點所在區(qū)域，這些抗原位點包括3個特異性抗原位點(69～83 aa、117～131 aa和169～183 aa)和3個空間上重疊的抗原位點(47～63 aa、165～200 aa和230～233 aa)[3,6-7]，其中Y-173，F(xiàn)-174，O-175及K-179是抗原識別的重要位點[8]，因此Cap蛋白具有良好的免疫原性[9]。流行病學(xué)分析表明，編碼Cap蛋白的ORF2基因常被選為主要靶基因用于區(qū)別PCV2和PCV1感染的分子標(biāo)識、PCV2毒株進化分析和PCV2分子流行病學(xué)調(diào)查，這是因為其擁有較少的labor-extensive序列、較短的基因長度和在PCV2和PCV1之間存在顯著的差異[2]。也正是因為這樣，Cap蛋白具有多態(tài)性，而這種特性又使得Cap蛋白在PCV2病毒的吸附、裝配、運輸和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用[3,10]。有關(guān)PCV2毒力的研究表明，ORF2基因上的1 331～1 339 nt基因序列決定了PCV2病毒復(fù)制力及其毒力[11]，且替代PCV2 Cap 蛋白的P110A或R191S位氨基酸能夠明顯促進PCV2復(fù)制[12]，說明Cap蛋白在PCV2病毒復(fù)制中起調(diào)控作用。最近的研究顯示，Cap蛋白單體由7個長短不一的loops結(jié)構(gòu)(Loop BC、Loop CD、Loop DE、Loop EF、Loop FG、Loop GH和Loop HI)和8個富含正電荷氨基酸氮端在內(nèi)的β-strands構(gòu)成。其中，位于核衣殼蛋白表面的大部分是loops結(jié)構(gòu)，包裹在核衣殼內(nèi)部的是β-strands，只有當(dāng)60個Cap蛋白組裝形成Capsid后才可見[13]。

2 Cap蛋白與其他蛋白的作用

PCV2因其結(jié)構(gòu)精簡，其復(fù)制需要依賴宿主細胞才能完成，這種依賴大多通過其衣殼蛋白Cap與宿主細胞因子相互作用來實現(xiàn)[1]。截止目前，共發(fā)現(xiàn)11種蛋白可以與Cap蛋白互作，分別是：2006年，Timmusk等[14]利用細菌雙雜交和GST pull-down試驗證明，Cap蛋白能與Rep蛋白、補體因子C1QBP、細胞黏附因子P-選擇素(P-selectin) 相互作用；2009年，F(xiàn)insterbusch等[15]利用酵母雙雜交和Co-IP試驗證明，Cap蛋白能與受體蛋白gC1qR、MKRN1蛋白(makorin ring finger protein 1)、前列腺凋亡反應(yīng)因子Par-4 (prostate apoptosis response- 4 gene)、核小體組裝蛋白NAP1 (nucleosome assembly protein 1)、核磷酸蛋白NPM1 (nucleophosmin，NPM1)和熱休克蛋白40 (heat shock protein 40，Hsp40)相互作用；同年，Zhang等[16]利用亞細胞共定位和Co-IP實驗證明，Cap蛋白能夠與α微管蛋白(α-tubulin)相互作用；2013年，Liu等[17]利用亞細胞共定位和Co-IP實驗證明，Cap蛋白能夠與熱休克蛋白70 (heat shock protein 70, Hsp70)相互作用。

2.1 Cap蛋白與Rep蛋白

PCV基因組進行復(fù)制時，需要一種Rep蛋白復(fù)合物(Rep和Rep'蛋白)。Rep蛋白含314個氨基酸，而由178個氨基酸構(gòu)成的Rep'蛋白是由編碼Rep蛋白的基因轉(zhuǎn)錄剪切而來。據(jù)共定位結(jié)果顯示，Rep蛋白和Rep'蛋白均存在于細胞核內(nèi)，但由于其結(jié)構(gòu)不同，結(jié)合DNA時的部位也不相同[18]。在PCV2復(fù)制過程中，病毒DNA被轉(zhuǎn)運至宿主細胞核內(nèi)合成雙鏈DNA中間體，Rep和Rep'蛋白與雙鏈DNA中間體結(jié)合，展開雙鏈DNA結(jié)構(gòu)并暴露出九聚體序列，緊接著Rep和Rep'蛋白識別并切割此序列，并以滾環(huán)方式進行基因組復(fù)制[18-19]。PCV1感染早期Cap蛋白定位于核仁，Rep蛋白定位于核質(zhì)，但在感染末期二者均定位于核質(zhì)，據(jù)此推測PCV1通過Cap-Rep互作調(diào)控其復(fù)制[14]。另有資料顯示，PCV2復(fù)制過程中其Rep蛋白會結(jié)合到Cap蛋白和中間絲蛋白syncoilin上共同參與PCV2的復(fù)制，并且在復(fù)制的不同時期，Rep和Rep'蛋白的比例不盡相同，但具體在復(fù)制周期中哪個階段發(fā)生相互作用及各自的功能和機制，目前尚無定論。

2.2 Cap蛋白與補體因子C1QBP

補體因子C1QBP是補體 C1 酶復(fù)合物的亞單位，而補體 C1 酶復(fù)合物能夠激活補體級聯(lián)效應(yīng)，參與宿主細胞防御，在機體固有免疫應(yīng)答中扮演重要角色[10,14]。通常，C1QBP利用其球頭部與抗體(IgG或IgM)結(jié)合而激活C1 酶，活化后的C1 酶參與諸多炎癥反應(yīng)。研究表明，PCV2 Cap不僅能夠與C1QBP在宿主巨噬細胞的細胞質(zhì)中相互作用，而且可以通過這種互作抑制C1QBP的泛素化降解過程，結(jié)果導(dǎo)致細胞內(nèi)的C1QBP大量集聚，過量的C1QBP通過PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強宿主巨噬細胞的吞噬能力，進而抑制PCV2的增殖[14,20-21]。

2.3 Cap蛋白與P-選擇素

P-選擇素是定位于血小板α顆粒和內(nèi)皮細胞管狀小體內(nèi)，分子量為140 kDa的膜糖蛋白，在細胞受到組織胺等物質(zhì)刺激、缺氧和損傷等情況下，迅速在質(zhì)膜上進行表達，參與細胞黏附[14,22]。早在2006年，Timmusk等[14]利用細菌雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)Cap蛋白能夠與P-選擇素相互作用，但直到現(xiàn)在仍未有試驗進一步證實這種互作及其蘊含的生物學(xué)意義。

2.4 Cap蛋白與受體蛋白gC1qR

gC1qR是補體C1q的受體，在除紅細胞外的幾乎所有哺乳動物細胞中均有表達，gC1qR與C1q結(jié)合，激活細胞免疫，在細胞防御過程中發(fā)揮重要作用[10]。如gC1qR能夠促進細胞的凋亡，這與其進入細胞線粒體內(nèi)部進行累積，造成線粒體功能障礙密切相關(guān)[23]。研究表明，gC1qR發(fā)揮以上功能與其能與多種細胞、病毒和細菌的蛋白結(jié)合密不可分[15]。通常，gC1qR與這些蛋白的結(jié)合發(fā)生在精氨酸簇中，巧合的是Cap蛋白的N 端也富含精氨酸且已被證明能夠與gC1qR互作[3,10,15]。更為有趣的是，有文獻報道gC1qR能通過與丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV) 的Core蛋白相互作用抑制宿主細胞中IL-12的生成[24-25]，而PCV2感染后的外周血單核細胞中IL-12的產(chǎn)量也會明顯降低[26]，因此PCV2極有可能通過其Cap蛋白與gC1qR的相互作用來抑制宿主細胞IL-12的表達，而且最近杜謙等關(guān)于PCV2對豬肺泡巨噬細胞IL-10、IL-12p40表達的影響及調(diào)控機制的研究中也證實了這一推測[27]。最近的研究表明，gC1qR與PCV2a Cap的相互作用比PCV1和PCV2b Cap的相互作用更強。在對該研究中使用的PCV1和PCV2 Cap蛋白的50個N-末端氨基酸進行比對后發(fā)現(xiàn)，第30和49位氨基酸可能決定其與gC1qR互作的緊密程度[28]。此外，考慮到Cap蛋白與補體因子C1qBP的相互作用及C1qBP與gC1qR之間的配、受體關(guān)系，推測Cap蛋白、C1qBP和gC1qR 三者之間可能會形成三元復(fù)合物，但其具體機制和對PCV2復(fù)制的影響還有待證實。

2.5 Cap蛋白與MKRN1蛋白

MKRN1基因是MKRN基因家族的根源，存在于多種哺乳動物細胞中，具有多種功能。MKRN1 cDNA全長1 449 bp，可編碼一個分子量約為53 kDa且屬于E3 泛素連接酶的轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子，該因子可通過誘導(dǎo)端粒酶亞單位hTERT泛素化和蛋白酶介導(dǎo)的降解來調(diào)節(jié)端粒酶的活性[29-31]。最近，有關(guān)西尼羅河病毒(West Niel Virus，WNV)衣殼蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，MKRN1在機體感染W(wǎng)NV過程中出現(xiàn)過表達，過量的MKRN1能夠誘導(dǎo)WNV Cap蛋白泛素化降解，進而抑制WNV通過其Cap蛋白所誘導(dǎo)的細胞凋亡[32]。有趣的是，Mankertz等[33]發(fā)現(xiàn)MKRN1單獨表達時呈斑點樣聚集于細胞核質(zhì)區(qū)域，而與PCV2 Cap蛋白共表達之后卻呈彌散樣分布于核質(zhì)。與此同時，PCV2 Cap蛋白的表達水平也出現(xiàn)顯著下降，這些結(jié)果表明MKRN1可能會促進PCV2 Cap蛋白的降解。截止目前，這種結(jié)論尚處于推測階段，有關(guān)Cap蛋白與MKRN1蛋白互作機制和生物學(xué)意義的闡述還需進一步研究。

2.6 Cap蛋白與前列腺凋亡反應(yīng)因子Par-4

Par-4蛋白是由342個氨基酸組成的分子量約為37 kDa的蛋白，因其首次發(fā)現(xiàn)于前列腺癌細胞中，故被命名為前列腺凋亡反應(yīng)因子，事實上Par-4蛋白具有多種功能，如調(diào)節(jié)細胞的伸縮和物質(zhì)運輸?shù)萚15]。目前，有關(guān)Par-4蛋白功能的研究也都集中于其促凋亡作用，且已查明Par-4蛋白是通過其C端的亮氨酸拉鏈區(qū)結(jié)合肌動蛋白絲和招募促凋亡蛋白(如DAP樣激酶和Amida)到肌動蛋白細胞骨架來促進凋亡[34-35]。盡管如此，PCV2 Cap蛋白與Par-4蛋白互作的發(fā)現(xiàn)并未將其與PCV2誘導(dǎo)凋亡的機制聯(lián)系起來，這是因為有資料顯示PCV2誘導(dǎo)的凋亡是由于機體發(fā)熱造成的，并非由PCV2作用于靶細胞引起。然而，由于PCV2感染早期其病毒樣顆粒(viral like particles，VLPs)與細胞表面的黏多糖結(jié)合后通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入宿主細胞，隨后分布于細胞初級內(nèi)體和溶酶體[15]，而這一過程相當(dāng)復(fù)雜，需要諸多蛋白的參與才能完成，其中就需要一個像Par-4這樣的蛋白來招募效應(yīng)蛋白到肌動蛋白細胞骨架，因此推測PCV2很可能就是通過其Cap蛋白與Par-4蛋白的相互作用將PCV2 VLPs募集至微絲并由此進入細胞核。目前，有關(guān)PCV2 Cap蛋白與Par-4蛋白互作的機制和功能還有待證實。

2.7 Cap蛋白與核小體組裝蛋白NAP1

NAP1在酵母、動植物中均保守存在，作為分子伴侶與組蛋白等堿性蛋白結(jié)合，在胞內(nèi)運輸過程中起作用[15]。研究表明，NAP1通過調(diào)節(jié)核小體的滑動或更改染色體上組蛋白H2A/H2B來改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)其代謝水平，進而影響細胞的分化乃至個體發(fā)育；通過與細胞周期蛋白互作調(diào)控細胞有絲分裂；通過與轉(zhuǎn)錄共激活因子p300/CBP 互作調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄；通過與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) Tat、人類乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV) E2和EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV) NA1蛋白互作促進病毒復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄[15,33,36]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，NAP1也能夠在蛋白激酶2(CDK2)的調(diào)節(jié)下進行核質(zhì)之間的穿梭，這個作用使其能在組蛋白代謝、動植物細胞生長分化及繁殖方面發(fā)揮重要功能[37]。因此，推測PCV2 Cap蛋白與NAP1蛋白互作既有可能影響PCV2 VLPs或Cap的運輸和裝配，又有可能影響PCV2的基因轉(zhuǎn)錄，但其在PCV2引起的疾病中所起的作用還需進一步研究。

2.8 Cap蛋白與核磷酸蛋白NPM1

核質(zhì)蛋白(nucleoprotein，NLP)和核磷蛋白NPM一起統(tǒng)稱為 NPM 蛋白家族，該蛋白家族包括NPM1、NPM2、NPM3、NLP四個成員，在核糖體生成、蛋白質(zhì)運輸、中心體復(fù)制和作為分子伴侶等方面發(fā)揮重要作用[15,38]。研究發(fā)現(xiàn)，NPM1蛋白能夠誘導(dǎo)諸多蛋白定位于核仁，這些蛋白包括腺病毒(adeno-associated virus，AAV)的Rep68和Cap蛋白、HIV的Rev和Tat蛋白、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和日本腦炎病毒(japanese encephalitis virus，JEV)的core蛋白以及豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的N蛋白等，而且NPM1蛋白與其互作蛋白的相互作用是由其互作蛋白上的NLS介導(dǎo)[15,33,38]。巧合的是，PCV2 Cap蛋白的N端也有一個NLS，而且該蛋白也已被證實能夠與NPM1蛋白互作，因此推測PCV2可能通過其Cap蛋白與NPM1蛋白的相互作用促進病毒衣殼的裝配。

2.9 Cap蛋白與Hsp40蛋白

Hsp40蛋白家族廣泛存在于多種生物細胞內(nèi)，這類蛋白都含有四個α螺旋區(qū)域：保守的C端、甘氨酸/苯丙氨酸(G/F)富含結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域及J結(jié)構(gòu)域。Hsp40蛋白參與細胞的多種生命活動，包括細胞應(yīng)激保護、蛋白質(zhì)折疊、重折疊或聚集與降解，以及蛋白質(zhì)移位等方面[39]。最近，不斷有研究發(fā)現(xiàn)Hsp40能與多種病毒存在相互作用，其中PCV1 最主要的免疫原性蛋白Cap與宿主Hsp40蛋白之間的相互作用關(guān)系早在2009年就已見報道，但是PCV2 Cap蛋白是否也能與Hsp40蛋白相互作用以及它們二者之間的這種互作關(guān)系所蘊含的生物學(xué)意義至今仍然未知[15]。巧合的是，宿主Hsp40蛋白是調(diào)控P58IPK活性的關(guān)鍵蛋白，而P58IPK蛋白又是細胞內(nèi)抑制PKR信號通路的關(guān)鍵蛋白，通常Hsp40與P58IPK以復(fù)合體Hsp40-P58IPK的形式存在并處于失活狀態(tài)，因此許多病毒都會借助于其所編碼的病毒蛋白與宿主Hsp40蛋白的互作來拆卸Hsp40-P58IPK復(fù)合體而釋放P58IPK蛋白，從而實現(xiàn)病毒對宿主PKR效應(yīng)的抑制并因而促進病毒的復(fù)制增殖，如流感病毒(influenza A virus，IAV)就是通過其核蛋白NP與宿主Hsp40互作而促使Hsp40從Hsp40-P58IPK復(fù)合體中解離，釋放的P58IPK發(fā)揮拮抗PKR效應(yīng)的作用[40]。因此，推測PCV2病毒也極有可能通過其Cap蛋白與宿主Hsp40蛋白的互作來調(diào)控宿主PKR信號通路。不僅如此，Hsp40與 MKRN1 類似，還可以參與蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解過程，例如Hdj1/ Hsp40可以促進人α-突觸核蛋白的泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解[41]，故PCV2 Cap蛋白與Hsp40蛋白的互作還有可能促進Cap蛋白的降解。

2.10 Cap蛋白與α-tubulin

α-tubulin可以指球狀蛋白質(zhì)的Tubulin蛋白超家族，也可以是超家族成員蛋白質(zhì)中的一種。α-tubulin和β-tubulin形成微管蛋白異二聚體是微管裝配的基本單位，而微管是真核細胞骨架的主要組成成份之一[42]。微管在許多重要的細胞過程中都有作用，包括有絲分裂，如抑制微管動力學(xué)，可以抑制癌細胞的細胞分裂，從而殺死癌細胞。2009年，Misinzo等[43]研究發(fā)現(xiàn)，抑制宿主細胞肌動蛋白的聚合能夠阻礙PCV2對上皮細胞的感染，提示PCV2可能會利用細胞骨架來幫助其復(fù)制和感染靶細胞。2014年，曹晶晶[44]利用激光共聚焦顯微鏡觀察PCV2由細胞外圍進入到細胞核的過程發(fā)現(xiàn)，PCV2感染第3 h位于細胞邊緣而到第15小時病毒蛋白聚集于核內(nèi)，進一步試驗發(fā)現(xiàn)重組桿狀病毒表達的PCV2 Cap蛋白處理的細胞中α-tubulin乙?；缴?，過表達去乙?；敢种苿㏕SA后PCV2增殖水平明顯上升，結(jié)果說明α-tubulin的乙?；梢栽鰪娢⒐艿木酆纤胶头€(wěn)定性并因此增加PCV2感染的幾率。因此，推測PCV2 可能通過其Cap蛋白與α-tubulin蛋白的互作來促進α-tubulin蛋白的乙?；?，進而促進PCV2復(fù)制和其對靶細胞的感染。

2.11 Cap蛋白與Hsp70蛋白

Hsp70與Hsp40同屬Hsp家族，Hsp70作用于Hsp40的J結(jié)構(gòu)域，這種互作使得Hsp40參與Hsp70 ATP酶活性的輔助調(diào)節(jié)過程[45]。最近，Liu等[46]研究發(fā)現(xiàn)Hsp70可促進PCV2的復(fù)制，但是它作用的具體機制至今尚未明確，考慮到Hsp70是PKR功能的細胞內(nèi)抑制劑，猜測Hsp70可能通過抑制PKR活性而促進PCV2的復(fù)制。此外，由于Cap蛋白既能與Hsp40互作，又能與Hsp70互作，而且Hsp40與Hsp70往往會形成二元復(fù)合體，因此Cap蛋白、Hsp70和Hsp40蛋白三者之間能否形成三元復(fù)合物以及其在PCV2生命周期中的作用還不清楚。

3 小 結(jié)

近年來，PCV2在國內(nèi)外廣泛流行，給養(yǎng)豬行業(yè)造成了重創(chuàng)，嚴重制約著我國乃至全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。市面上也有多種品牌PCV2商品疫苗，對控制PCV2具有一定的效果，但這些疫苗大多是全病毒滅活性疫苗，其滅活病毒難以純化，導(dǎo)致PCV2仍在流行。亞單位疫苗和基因工程疫苗雖取得了一定成果，但其遺傳安全性備受爭議，距大規(guī)模市場生產(chǎn)仍有一大段距離。由于PCV2獨特的開放閱讀框，其Cap蛋白成為疫苗的首選對象，但Cap蛋白與其他蛋白互作的具體機制和功能等仍未研究清楚。因此，進一步研究PCV2 Cap蛋白與宿主蛋白之間的相互作用，將為揭示PCV2致病機理提供理論依據(jù)，更為PCVAD的診斷、預(yù)防和治療提供新的策略或治療靶點。