高效液相色譜法測定化妝品中水楊酸的不確定度評定

張慧敏，彥培傲，徐志杰，鞠玲燕

(1.山東省海洋經(jīng)濟(jì)藻類資源開發(fā)與利用工程技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 威海 264300；2.威海海洋職業(yè)學(xué)院海洋生物與醫(yī)藥系，山東 威海 264300;3.威海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，山東 威海 264205)

如果化妝品遭受微生物的侵入，品質(zhì)將會(huì)受到嚴(yán)重影響,影響使用者健康,通常加入防腐劑抑制微生物。水楊酸為有機(jī)酸類防腐劑，具有較強(qiáng)的抗真菌作用[1],也有較好美容效果[W]，故水楊酸常被商家利用。但若過量使用水楊酸，會(huì)危及健康。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)規(guī)定水楊酸在化妝品中的限量為0.5 %，而且，除香波外，不得用于三歲以下兒童使用的產(chǎn)品中[3]。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)規(guī)定水楊酸的測定方法為高效液相色譜法[3]，而且目前已報(bào)道測定水楊酸的方法也多為高效液相色譜[4-7]，液相色譜法簡便，快捷。本文對高效液相色譜法檢測化妝品中水楊酸含量的不確定度進(jìn)行了評定，不確定度是測量結(jié)果的定量表征，檢測結(jié)果是否有效，主要在于其不確定度的多少[8]。在檢測過程中，因素復(fù)雜和檢測結(jié)果評定的多樣性，導(dǎo)致結(jié)果會(huì)帶有一定的不確定性，影響產(chǎn)品合格判定、司法裁定等[9-11]。為此，本文依據(jù)JJF1059.1-2012計(jì)量技術(shù)規(guī)范[12]，參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)[3]中高效液相色譜法測定化妝品中水楊酸含量，建立數(shù)學(xué)模型，對檢測結(jié)果進(jìn)行不確定度評定，希望為評定測量方法和結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

Aglient 1260高效液相色譜儀，配在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，美國Aglient公司；Ohaus DV215CD電子分析天平(d=0.1mg)；超聲波提取儀(SB5200)：上海諾頂儀器設(shè)備有限公司。計(jì)量檢定合格的A級玻璃量器。

甲醇、磷酸，色譜純，CNW公司；水楊酸(95%)，Dr.Ehrenstorfer；乳液樣品(市售)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 環(huán)境條件

溫度(22±3)℃，相對濕度≦75%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取1000 mg水楊酸于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成50 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存。

1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液A：量取0.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成10 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液A。

10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液B：量取 1 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液A于100 mL容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成100 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液B。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)中間液B 500μL，標(biāo)準(zhǔn)中間液A 10,50,100,200μL置于2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，用醇+水(75+25)溶液定容至1mL，濃度依次見下表，作為S1～S5，現(xiàn)用現(xiàn)配，如表1所示，供高效液相色譜測定。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制表

2.3 樣品前處理

取樣品0.2500 g于25 mL具塞比色管中，加入20 mL甲醇水溶液(75+25)，渦旋1min后，用超聲波提取儀提取15 min，用甲醇+水(75+25)溶液定容至25 mL，用0.45μm有機(jī)濾膜過濾，保存于2 mL棕色進(jìn)樣瓶中作為待測溶液。

2.4 色譜條件

Aglient C8色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：20 μL；檢測波長：300 nm。

2.5 數(shù)學(xué)模型

式中：X——試樣中水楊酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為μg/g；

c——由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中得到的水楊酸含量，單位為μg/mL；

V——樣液最終體積，單位為mL；

m——最后樣液的質(zhì)量，單位為g；

D——稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度來源分析

結(jié)合檢測流程及不確定度數(shù)學(xué)模型分析，化妝品中水楊酸含量測定的不確定度主要來源于測量重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)品配制、樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入。

3.2 不確定度分量的量化

3.2.1 重復(fù)性測量引起的不確定度

平行制備6份樣品，分別加入標(biāo)準(zhǔn)中間液A 10μL，使得樣品加標(biāo)濃度為40μg/g。6份加標(biāo)樣品的水楊酸測定值分別為39.27 ,40.70 ,36.49,37.29,38.11 ,40.81 μg/g，平均為38.78 μg/g。單次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

(其中n=6)

因?qū)嶋H進(jìn)行兩次平行樣品檢測，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

μg/g (其中m=2)

由重復(fù)性測量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

電子天平品牌，型號為Ohaus DV215CD，1級，該天平最大允許誤差為0.1mg，引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

實(shí)際上進(jìn)行空盤和毛重兩次稱量，產(chǎn)生的不確定度u(m)為：

稱量1000.00mg水楊酸標(biāo)準(zhǔn)品，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m1)如下：

3.2.3 配制標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

使用到容量瓶的規(guī)格有100 ,50,10mL，刻度吸管1mL、移液管1mL，經(jīng)檢定都是A級。

3.2.3.1 1mL刻度吸管移取0.5mL溶液引入的不確定度

(1)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定，1mL A級刻度吸管移取0.5mL溶液，最大容量允差為±0.008mL，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度：實(shí)驗(yàn)室溫度波動(dòng)通常為±3℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-1/℃，按照矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(3) 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(v0.5)

(4) 引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v0.5)

3.2.3.2 1mL移液管引入的不確定度

(1)校準(zhǔn)引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定，1mL A級移液管最大容量允差為±0.007mL，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度：標(biāo)準(zhǔn)參照3.2.3.1(2)，由溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(3) 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(v1)

(4) 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v1)

3.2.3.3 100mL容量瓶引入的不確定度

(1) 校準(zhǔn)引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定，100mL A級容量瓶最大容量允差為±0.10mL，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度

(3) 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(v50)

(4) 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v100)

3.2.3.4 50mL容量瓶引入的不確定度

(1) 校準(zhǔn)引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定，50mLA級容量瓶最大容量允差為±0.05mL，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度

(3) 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(v50)

(4) 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v50)

3.2.3.5 10mL容量瓶引入的不確定度

(1) 校準(zhǔn)引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定，10mL A級容量瓶最大容量允差為±0.02mL，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度

(3) 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(v10)

(4) 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v10)

以上過程引入的相對不確定度為：

3.2.4 樣品溶液濃度引入的不確定度

3.2.4.1 樣品稱重

天平品牌型號為Ohaus DV215CD，為1級，其最大允許誤差為0.1mg，根據(jù)矩形分布，稱量誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

實(shí)際上進(jìn)行空盤和毛重兩次操作，不確定度u(m)為：

用上述天平稱取0.2500g，引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m2)為：

3.2.4.2 定容引入的不確定度

1mL定容引入的不確定度

(1)校準(zhǔn)引入的不確定度：評定標(biāo)準(zhǔn)參照3.2.3.2(1)，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度：

(3) 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(v1)

(4) 1mL移液管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(v2)

3.2.5 由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

由五組濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，如表2所示。

表2 由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度計(jì)算表

標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為：

式中： S——水楊酸溶液響應(yīng)信號殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；

b———回歸方程斜率；

m———待測物的測定次數(shù)；

n———標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)；

xi———從標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的水楊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定值；

yi———是相對于xi的測定值。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度為U(curve) =0.01875233，相對不確定度為：Urel (curve)= 0.0004836

3.2.4 由方法回收率引入的不確定度

3.2.5 由分析儀器引入的不確定度

液相色譜儀安捷倫1260 (HDle-2017-12-2507612)的校準(zhǔn)證書提供其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel (e) =0.04。

3.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(X)的計(jì)算

通過以上分析，該方法各分量不確定度見表3。

表3 各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

因此，合成不確定度為：

U(x)=0.05550×38.78=2.1523μg/g

3.4 擴(kuò)展不確定度U的計(jì)算

以95%為置信概率，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以2(k=2)，得到擴(kuò)展不確定度為：

U=U(x)×k=2.1523×2=4.3046μg/g

3.5 測量不確定度的結(jié)果報(bào)告

按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)測定乳液中水楊酸，本乳液中水楊酸測定結(jié)果表示為(38.78±4.3046) μg/g(k=2)。

4 結(jié)論

本文從標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱量、樣品定容、重復(fù)性測試等方面對不確定度進(jìn)行評定，依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)測定化妝品中水楊酸含量時(shí)，不確定度的主要來源是樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)品配制過程、重復(fù)性測定，儀器等。