鹽酸柯諾拉贊的胚胎-胎仔發(fā)育毒性

蔡 鳴，舒 斌*，邵 卿，袁艷娟，張玉堂，喬紅群，劉 晶

(1江蘇省藥物研究所江蘇省藥物安全性評價中心，南京 210009；2南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京 211816)

沃諾拉贊-(vonoprazan,商品名Takecab)是由日本武田制藥公司研制的一種新型鉀離子競爭性酸阻斷劑，為可逆性質(zhì)子泵抑制劑，2014年12月被批準(zhǔn)在日本上市，用于治療幽門螺桿菌感染、胃食管反流、消化性潰瘍、十二指腸潰瘍、食管炎、胃潰瘍等胃酸相關(guān)性疾病[1-2]。沃諾拉贊-半衰期長，抑酸作用強(qiáng)而持久，不受CYP2C19基因多態(tài)性影響，治療的個體差異小。沃諾拉贊-以富馬酸鹽形式成藥，在臨床治療腐蝕性食管炎、幽門螺旋桿菌(Hp)根除中相比蘭索拉唑表現(xiàn)出優(yōu)效，為胃酸相關(guān)疾病的患者提供了新的治療選擇[3-6]?？轮Z拉贊為沃諾拉贊-的結(jié)構(gòu)類似物，作用機(jī)制與沃諾拉贊-相似，通過抑制K+和H+-K+-ATP酶(質(zhì)子泵)結(jié)合達(dá)到抑制并提前終止胃酸分泌的目的。為評價鹽酸柯諾拉贊的藥物安全性，本研究采用大鼠進(jìn)行胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗及其伴隨毒代動力學(xué)研究，為其后續(xù)研究和臨床試驗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

富馬酸沃諾拉贊-對照品(批號20140602，純度：99.6%，分子式C21H20FN3O6S)與鹽酸柯諾拉贊(KFP-H008，批號LF20160113，純度：99.4%，分子式C22H25FN2O4S)均由江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司提供。氯化鈉注射液為市售制劑，試驗用水為實驗室自制去離子水(Milli-Q制備)。

1.2 動 物

SPF級SD大鼠，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK京2012-0001，合格證號11400700184151?！?20只，♀240只，飼養(yǎng)于江蘇省藥物安全性評價中心動物房，實驗動物使用許可證(蘇)2016-0032。屏障環(huán)境溫度21.0～24.9 ℃，相對濕度42.1%～50.5%。

2 方 法

2.1 胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究[7]

SD大鼠按雄雌2∶1比例合籠，每天早上對雌鼠進(jìn)行陰道涂片檢查，顯微鏡下查見精子視為交配成功，當(dāng)天定為妊娠第0天(GD 0)。交配成功者按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組24只，4只一籠飼養(yǎng)。參照鹽酸柯諾拉贊的大鼠經(jīng)口給藥LD50和相關(guān)指導(dǎo)原則，設(shè)低、中、高劑量(20、60、200 mg/kg)組，另設(shè)溶劑和陽性對照組(環(huán)磷酰胺)，分別連續(xù)經(jīng)口給藥10 d(GD 6～15)。于GD 0、GD 3、GD 6、GD 10、GD 13、GD 16、GD 19時稱取體質(zhì)量和加食量，次日稱取剩食量，計算攝食量。于受孕GD 20處死孕鼠，記錄黃體數(shù)、著床數(shù)、死胎數(shù)、活胎數(shù)以及活胎重量、性別、外觀異常等。將約1/2胎仔固定于Bouin氏液中做內(nèi)臟檢查，另1/2固定于70%乙醇中制作骨骼標(biāo)本后做骨骼畸形檢查。

2.2 伴隨毒代動力學(xué)研究

在對SD大鼠進(jìn)行胚胎-胎仔發(fā)育研究時，以衛(wèi)星組的形式進(jìn)行伴隨毒代動力學(xué)研究。鹽酸柯諾拉贊低、中、高劑量組中每組15只衛(wèi)星組孕鼠。用于血藥濃度檢測的衛(wèi)星A、B組孕鼠分別用于動物首(單次)、末次(重復(fù))給藥時采集血樣，時間點(diǎn)依次為給藥前、給藥后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、7 h、10 h、24 h。采得的血樣在1 h內(nèi)以3 000 r/min，8 ℃離心10 min，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ糜诮M織分布檢測的衛(wèi)星C組孕鼠連續(xù)給藥至GD 19，并于GD 19給藥后1 h，采集血樣并快速放血處死動物，立即剖取孕鼠的心、肝、肺、腎、胎盤，以及胎仔的心、肝、肺、腎等，用生理鹽水洗凈后轉(zhuǎn)移至聚丙烯管，保存于-20 ℃。溶劑對照組采集2只孕鼠的空白樣本。鹽酸柯諾拉贊的定量測定采用HPLC-MS/MS方法檢測。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法

各項指標(biāo)檢查結(jié)果經(jīng)SPSS 20.0軟件包統(tǒng)計處理。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié) 果

3.1 胚胎-胎仔發(fā)育毒性

給藥期間，鹽酸柯諾拉贊未對動物的一般狀況造成明顯影響。與溶劑對照組相比，高劑量組在GD 10、GD 13、GD 16時耗食量減少明顯(表1)；同期，高、中劑量組動物體重也明顯輕于對照(表2)。此外，高、中劑量組動物的總增重也較明顯小于溶劑對照組(P<0.05)。

鹽酸柯諾拉贊各劑量組的活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、著床數(shù)、黃體數(shù)、子宮總重、胎盤總重、性別比與溶劑對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。

GroupGD 0GD 3GD 6GD 10GD 13GD 16GD 19Negative con-trol20.46±5.2222.75±1.7226.04±1.6427.96±3.6528.75±4.0727.67±1.6226.96±1.56Low-dose20.89±6.5322.67±1.9324.29±0.9726.04±1.0227.04±3.1627.71±2.2625.67±1.50Medium-dose20.25±1.3822.13±1.7924.29±1.3925.21±4.7324.38±2.3727.58±2.1727.63±5.06High-dose20.26±3.9022.88±1.3919.67±4.9617.79±4.87*15.54±2.41*16.00±4.79*21.17±6.73Positive control20.97±2.9822.75±2.2123.38±2.0922.13±3.67*23.42±2.52*26.29±4.4926.63±0.95

*P<0.05vsnegative control group

GroupGD 0GD 3GD 6GD 10GD 13GD 16GD 20Weight gainsNegative control(n=23)251.00±14.23271.43±16.13288.61±18.29314.52±20.40334.52±19.64358.13±20.90413.09±24.36162.09±21.27Low-dose(n=22)250.82±11.74266.05±12.08285.27±12.43304.18±15.07320.32±19.59346.77±19.16403.00±28.12152.18±24.93Medium-dose(n=22)252.09±13.30270.32±16.46286.09±17.64300.36±22.27*318.45±23.50*338.55±28.18*392.18±40.20140.09±34.06*High-dose(n=21)246.62±8.56265.95±11.50282.43±14.27288.90±14.65*294.38±16.69*308.09±18.17*359.52±28.38*112.90±25.76*Positive control(n=23)249.96±9.27269.00±11.23286.78±11.69298.74±17.10*312.22±18.03*331.00±18.21*378.17±21.09*128.22±20.32*

*P<0.05vsnegative control group

GroupLive fetuses/dam (n)Dead fetuses/dam (n)Resorptions/dam (n)Implantation sites/dam (n)Corpora lutea/dam (n)Gravid uterus weight/gPlacentaal weight/gNegative control(n=23)13.09±3.9600.43±0.7913.52±3.8914.00±2.8478.21±19.419.05±2.67Low-dose(n=22)13.00±3.8800.41±0.7313.41±3.7214.09±2.3176.44±21.568.78±2.68Medium-dose(n=22)12.23±5.3000.91±1.6313.14±4.6014.41±2.9271.95±26.518.03±3.08High-dose(n=21)12.38±3.7501.33±2.1813.71±3.5214.43±2.7568.16±20.048.14±2.48Positive control(n=23)13.09±2.370.04±0.210.83±0.9813.96±2.2915.00±1.5162.68±9.96*5.61±1.10*

*P<0.05vsnegative control group

由表4可看出，鹽酸柯諾拉贊高劑量組動物的胎鼠頂臀長顯著短于溶劑對照組(P<0.05)。

胎鼠內(nèi)臟檢查未見畸形發(fā)生。骨骼檢查，鹽酸柯諾拉贊高劑量組136個樣本中出現(xiàn)枕骨骨化不全8例，胸骨骨化不全86例，肋骨變異或畸形5例，四肢骨骨化不全110例；中劑量組138個樣本中出現(xiàn)枕骨骨化不全7例，肋骨變異或畸形4例，四肢骨骨化不全75例，經(jīng)χ2檢驗發(fā)現(xiàn)，與溶劑對照組相比均有顯著差異。中、低劑量組出現(xiàn)的胸骨骨化不全數(shù)量與溶劑對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(表5)，說明中、高劑量的鹽酸柯諾拉贊可對胎仔的骨骼發(fā)育產(chǎn)生比較明顯的影響。

GroupSex ratio (f/m)Ccrown rump length/cmFetal weight/gNegative control(n=23)0.96±0.573.65±0.244.03±0.59Low-dose(n=22)1.54±0.773.57±0.133.84±0.25Medium-dose(n=22)1.03±0.693.62±0.323.93±0.76High-dose(n=21)1.38±0.853.44±0.18*3.66±0.36Positive control(n=23)1.40±0.973.23±0.17*3.15±0.26*

*P<0.05vsnegative control group

Table5 Skeletal alterations on fetus from pregnant rats treated with carenoprazan hydrochloride during GD 6-15

GroupNumber of fetuses (n)Parietal boneSternumRibLimb boneCoccyxNegative control1590690680Low-dose1482683760Medium-dose1387*694*75*0High-dose1368*86*5*110*0Positive control15823*154*7*143*1

*P<0.05vsnegative control group,by χ2test

3.2 伴隨毒代動力學(xué)研究

鹽酸柯諾拉贊低(20 mg/kg)、中(60 mg/kg)劑量組首(單次)、末(多次重復(fù))次給予孕鼠口服后，測得鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物達(dá)峰時間約為0.5～1 h，而高劑量(200 mg/kg)組均有所延遲，約為2 h。

由表6可看出，多次重復(fù)給藥后，中劑量組鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物的AUC0-t均較首次顯著增高(P<0.05)，存在蓄積傾向；但代謝產(chǎn)物的cmax較首次明顯降低(P<0.05)。高劑量組鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物在動物體內(nèi)的暴露(cmax、AUC0-t)較首次出現(xiàn)不同程度的降低。3個劑量組末次給藥后測得鹽酸柯諾拉贊的cmax分別為首次給藥后的1.3、1.9、0.9倍，AUC0-t分別為首次的1.4、3.0、0.8倍。各劑量組末次代謝產(chǎn)物的cmax分別為首次的0.7、0.7、0.6倍，AUC0-t分別為首次的1.0、1.8、0.6倍。

在20～200 mg/kg劑量范圍內(nèi)，單次給予鹽酸柯諾拉贊的孕鼠血漿原形藥物cmax與劑量呈等比例增長，呈現(xiàn)線性動力學(xué)特征。但其代謝產(chǎn)物則未表現(xiàn)出線性特征(表6)。此外，多次給藥后的孕鼠血漿中鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物的cmax均與劑量變化不成比例，呈現(xiàn)非線性動力學(xué)特征。單次及多次給藥后的鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物的AUC0-t增長的比例均高于劑量的改變，呈現(xiàn)非線性動力學(xué)特征。

Group Pregnant females (n)ParameterLow-dose (n=5)Medium-dose (n=5)High-dose (n=5)Drug prototypeSingle doseAUC0-t/(μg/L·h)437.5±75.01 700.2±247.213 467.1±11944.9cmax/(ng/mL)127.3±29.3359.8±141.11 043.4±882.7Repeated doseAUC0-t/(μg/L·h)621.4±250.15 145.2±1 874.1*10 199.5±3 489.8cmax/(ng/mL)167.6±124.3673.8±469.1973.6±286.5MetaboliteSingle doseAUC0-t/(μg/L·h)677.9±411.32 835.4±2 108.512 974.2±8 524.5cmax/(ng/mL)440.2±215.2907.0±114.41 366.8±1 004.7Repeated doseAUC0-t/(μg/L·h)706.5±497.55 333.9±607.9*8 164.4±2 780.9cmax/(ng/mL)319.6±236.8661.6±118.8*760.6±239.6

*P<0.05vssingle dose group

孕鼠灌胃給予鹽酸柯諾拉贊后，其在肝、肺中的含量較高，胎盤、心中含量較低，但均高于血漿。鹽酸柯諾拉贊可透過胎盤屏障進(jìn)入胎仔體內(nèi)，所測得臟器分布趨勢與母體相近，以肝含量最高、心含量最低，且均低于母體胎盤的含量(表7)。代謝產(chǎn)物的分布與原形有所不同，其在肝、腎中的含量較高；胎盤、肺、心中含量較低，且均低于血漿(表8)。各劑量組胎仔體內(nèi)的代謝產(chǎn)物分布趨勢與母體相近，肝含量最高、心含量最低，且均低于母體胎盤中的含量。

4 討 論

沃諾拉贊-的上市為治療胃酸相關(guān)性疾病提供了新的選擇，但有關(guān)其用藥安全性的報道相對較少。本研究首次報道了將較高劑量(20～200 mg/kg)的鹽酸柯諾拉贊給予懷孕動物后的代謝情況及其對母鼠和胎鼠的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在致畸敏感期灌胃給予孕鼠60和200 mg/kg的鹽酸柯諾拉贊對母體和胎仔均產(chǎn)生了明顯的毒性反應(yīng)，而20 mg/kg劑量則未見明顯影響。

GroupLow-doseMedium-doseHigh-dosePregnant females (n)(n=4)(n=5)(n=5) MaternalPlasma (μg/mL)0.127±0.0320.264±0.1770.737±0.152Heart (μg/g)1.625±0.3313.564±1.4677.500±1.764Liver (μg/g)5.338±1.25310.860±4.44746.940±11.161Lung (μg/g)22.338±6.02637.940±9.02786.950±26.940Kidney (μg/g)3.740±1.7748.07±5.5921.12±8.58Placenta (μg/g)1.508±0.6292.97±0.8214.94±6.10 FetusHeart (μg/g)0.008±0.0150.034±0.0610.189±0.086Liver (μg/g)0.094±0.0810.285±0.2251.169±0.359Lung (μg/g)0.085±0.0500.284±0.1870.937±0.226Kidney (μg/g)0.018±0.0190.119±0.1230.307±0.253

GroupLow-doseMedium-doseHigh-dosePregnant females (n)(n=4)(n=5)(n=5) MaternalPlasma (μg/mL)0.578±0.2230.618±0.2610.800±0.191Heart (μg/g)0.490±0.0880.550±0.2680.564±0.275Liver (μg/g)9.138±2.26710.710±2.89118.480±2.913Lung (μg/g)0.718±0.2260.544±0.0430.702±0.135Kidney (μg/g)1.790±0.7132.436±1.5242.242±0.848Placenta (μg/g)0.240±0.0800.290±0.0460.470±0.185 FetusHeart (μg/g)0.013±0.0050.026±0.0070.065±0.034Liver (μg/g)0.079±0.0200.153±0.0340.409±0.149Lung (μg/g)0.028±0.0030.060±0.0110.173±0.059Kidney (μg/g)0.027±0.0070.066±0.0250.158±0.064

在進(jìn)行SD大鼠生殖毒性研究的同時，本研究以衛(wèi)星組的形式進(jìn)行伴隨的毒代動力學(xué)研究，以觀察鹽酸柯諾拉贊在孕鼠及胎仔體內(nèi)的暴露情況，考察受試藥是否可以通過胎盤屏障，結(jié)合其毒性研究結(jié)果給予可能的解釋。沃諾拉贊-口服后能吸收迅速，主要通過肝微粒體酶CYP3A4代謝，游離堿形式在血漿中迅速消失，而在胃組織中累積，給藥24 h后在胃組織中仍然存在[8]。59%以代謝物的形式從尿液排出，僅有8%以游離堿原形從尿液排出[1]。已知的4個代謝產(chǎn)物均無藥理活性[9]。在急性肝損傷模型大鼠體內(nèi)，沃諾拉贊-暴露量AUC顯著增加，消除半衰期延長，表明急性肝損傷狀態(tài)下沃諾拉贊-在大鼠體內(nèi)的吸收和消除均受到影響[10]。由于妊娠期動物存在生理方面的迅速變化，進(jìn)而可能引起藥物代謝動力學(xué)的改變。參考上述數(shù)據(jù)，本研究進(jìn)行了孕鼠口服較高劑量的鹽酸柯諾拉贊后的血藥濃度檢測，發(fā)現(xiàn)藥物同樣吸收迅速，達(dá)峰時間約為0.5～1 h。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸柯諾拉贊及其代謝產(chǎn)物可透過胎盤屏障進(jìn)入胎仔體內(nèi)，且臟器分布趨勢與母體相近，均以肝中含量為最高。因此中、高劑量組出現(xiàn)的胎仔發(fā)育毒性應(yīng)與鹽酸柯諾拉贊透過胎盤屏障相關(guān)。此外，單次與多次給予鹽酸柯諾拉贊后的血藥濃度cmax變化情況有較大不同，其原因尚待進(jìn)一步的研究。