濃縮生長因子研究進(jìn)展及其對犬貓疾病治療的作用

紀(jì)婷，趙天旭，夏楠，饒宇騰，高蕊，李婕，陳武

（1.北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)中醫(yī)藥北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.寵福鑫中西結(jié)合國際動物診療中心，北京102206；3.北京圣銘宬科貿(mào)有限公司公司，北京 100012）

1 進(jìn)展

1984年，Assoion等人提取人血漿中的富血小板血漿（Platelet.rich plasma，PRP），發(fā)現(xiàn)其中含有多種生長因子：血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、骨形成蛋白（BMPs）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、類胰島素生長因子（IGF）、表皮生長因子（EGF）以及成纖維細(xì)胞生長因子 （FGF）等[1]，PRP即為第一代血小板濃縮物。但是，PRP的缺點(diǎn)是需要在牛凝血酶的作用下才能釋放出其中的生長因子，發(fā)揮其功能；而且釋放生長因子的持續(xù)作用時間短，對促進(jìn)組織再生修復(fù)持續(xù)時間也相應(yīng)較短[2]。

第二代的血小板濃縮物（Plasma-rich growth factors，PRF），是由Choukroun首次提出[3]。抽取患者的新鮮血液，經(jīng)離心機(jī)離心分離制備得到粘稠狀富纖維蛋白凝膠。在此過程中，血小板被激活，同時釋放大量生長因子，從而起到止血和消炎的作用，更重要的是，可促進(jìn)組織愈合及血管的生成。PRF與PRP相比較，PRF釋放生長因子的持續(xù)作用時間長，制備簡便，具有較強(qiáng)的抗拉力和撕扯能力，已廣泛地應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3]。

第三代血小板濃縮物（Concentrated growth factors，CGF），是由Sacco于2006年首先介紹[4]，是用特殊的離心機(jī)將靜脈血進(jìn)行離心制備而來，無需加入添加劑，避免了異種抗原引起的潛在風(fēng)險。與PRF相比，離心速度不同。CGF中的纖維蛋白凝塊更大更密集，在移植后其釋放生長因子的持續(xù)時間為7 d，生長因子更豐富，顯示了更好的再生性能和更多的功能性。對于臨床而言，其擁有更高的拉伸強(qiáng)度、粘合強(qiáng)度、抗凝血時間等。CGF具有可膜制性，通過壓縮可以表現(xiàn)為薄膜的形式，CGF凝膠壓制成膜后具有覆蓋、保護(hù)、屏障和促進(jìn)愈合的作用，從而可以粘附于缺損區(qū)，因此可以促進(jìn)軟組織及骨組織缺損區(qū)的組織愈合。已有研究表明，其在提高骨組織修復(fù)方面的效果令人滿意，并且能夠促進(jìn)軟組織快速愈合，減少術(shù)后瘢痕形成[5]。在臨床中CGF可在種植、上頜竇提升、軟組織缺損、美容等方面應(yīng)用，CGF在臨床上的使用形式多種多樣，如凝膠狀、膜狀、液體狀等[6]。對前兩代血液提取物富血小板血漿和富血小板纖維蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，其促進(jìn)組織缺損修復(fù)的作用主要依賴于其內(nèi)含有的大量血小板生長因子、白細(xì)胞和纖維蛋白。對于PRP和富血小板纖維蛋白的超微結(jié)構(gòu)已有文獻(xiàn)報道，但尚未發(fā)現(xiàn)對CGF的超微結(jié)構(gòu)的研究報道。

2 CGF的制備、生物學(xué)特性及其作用特點(diǎn)

CGF的制備是由意大利塞法登特（Silfradent）公司繼第一代血小板富集血漿-PRP（platelet-rich plasma）后，研發(fā)出提取新一代濃縮生長因子的組織修復(fù)系統(tǒng)。

將患者的靜脈血放于Medifuge離心加速器（Silfradent，Italy）的轉(zhuǎn)筒中，設(shè)定制備CGF程序，即可得到CGF纖維網(wǎng)狀蛋白凝膠支架。其分為3層，最上層為血清，底層為紅細(xì)胞及血小板，中間纖維蛋白層即為CGF被分離出來存放于稀釋的抗菌溶液中，底層部分可以與混合生物材料及自體骨混合，用作填料。CGF單獨(dú)或與骨替代材料混合，放于缺損組織處，可以促進(jìn)骨組織成骨，軟組織愈合[2]。制備過程中，由于特殊的變速離心使血小板激活，從而釋放出組織再生所需的各種生長因子：PDGF、TGF-β、BMPs、VEGF、IGF、EGF以及FGF等[7]。

血小板衍生物來源于自體血，避免了免疫排異反應(yīng)，從根本上解決了疾病傳染的發(fā)生及移植成功率低的現(xiàn)狀，含有多種生長因子，集合了多種生長因子的多種作用，又可以發(fā)揮相互之間的相互作用，從而促進(jìn)組織再生，傷口愈合，發(fā)揮抗感染能力。在臨床上CGF可以依據(jù)不同需求以膜狀、凝膠狀、液體狀的形式使用，且不用加入任何催化成分，更加簡便、安全，更適用于臨床的應(yīng)用[8]。

3 CGF的質(zhì)量保障及檢測方法與技術(shù)

Medifuge離心加速機(jī)制備出的濃縮生長因子，可用酶聯(lián)免疫試劑盒測定CGF中含有TGF-β1、IGF-1、VEGF-A、PDGF-BB、FGF、BMPs-2、EGF和骨保護(hù)素等活性因子[9]。陳飛等[10]經(jīng)過實(shí)驗(yàn)研究制備1 d后TGF-β1和VEGF在CGF凝膠層析出液中的濃度分別約為其在上清層濃度的2.67倍和1.8倍，表明離心作用有效地使TGF-β1等生長因子濃縮在凝膠層。王天祥等[7]通過使用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定靜脈血、CGF中VEGF、TGF-β1等的濃度，且CGF與靜脈血相比之下，CGF中VEGF的含量增加了（21.90±2.44）倍，TGF-β1的含量增加了（7.59±2.03）倍，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明濃縮生長因子具有純化且提高血液中VEGF、TGF-β1等生長因子濃度的作用，使CGF中含有高濃度生長因子，進(jìn)一步發(fā)揮其抗感染、促進(jìn)骨組織形成、加速組織愈合等作用。

4 對犬貓疾病防治作用分析

4.1 角膜損傷

角膜損傷性疾病是當(dāng)今世界上主要致盲性眼病之一，目前臨床上導(dǎo)致角膜致盲較為常見的原因主要有上皮損傷和角膜內(nèi)皮損傷[11]。一般疾病發(fā)生，主要治療方式還是手術(shù)治療：主要包括全層角膜移植手術(shù)，也稱其為穿透性角膜移植術(shù)（enetrating keratoplasty，PIo）、板層角膜移植術(shù)（Lamellar keratoplasty，LPK）和角膜內(nèi)皮移植術(shù)（Endothelial keratoplasty，EK）[12]。角膜移植術(shù)與其它器官移植相比，角膜移植是有著相當(dāng)大的成功率。但是每年角膜供體短缺問題一直未得到有效的改善，且角膜移植存在很高排斥反應(yīng)。CGF中與角膜瘢痕關(guān)系最密切的是TGF-β。TGF-β1、2、3的mRNA可在正常犬貓角膜上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中檢測到，TGF-β1、2的mRNA可在角膜基質(zhì)細(xì)胞中檢測到[13]。當(dāng)角膜受到創(chuàng)傷后，其TGF-β1、2、3及其受體的表達(dá)增多[14]；并且角膜霧狀混濁的輕重與角膜TGF-β1mRNA的強(qiáng)弱也密切相關(guān)[15]；TGF-β可抑制眼睛表面瘢痕的形成，將其應(yīng)用到臨床角膜疾病可取得一定療效。

4.2 口腔潰瘍

該疾病除哺乳犬貓外，各年齡、性別以及品種的犬貓都有可能發(fā)生，以夏季為多[16]。患病動物主要表現(xiàn)為無食欲，流涎，精神沉郁，不讓接觸，幾乎不能飲食。全身治療多是對因治療，采用補(bǔ)充維生素，減少發(fā)作次數(shù)[17]。局部治療以促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合，緩解患病動物疼痛為目的。CGF中TGF-β、VEGF、PDGF、IGF和BMPs等。這些生長因子可以提高表皮細(xì)胞的移動能力，減少瘢痕的形成，促使肉芽組織快速生長，并且能輔助中性粒細(xì)胞加強(qiáng)機(jī)體防御，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合[17]。CGF在慢性潰瘍的治療中有積極作用[18]。

4.3 創(chuàng)傷愈合

創(chuàng)傷愈合是表皮細(xì)胞增生覆蓋創(chuàng)面的再上皮化和進(jìn)入傷口的成纖維細(xì)胞增殖、分化和合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)的纖維化以及新生血管長入傷口的血管化等綜合作用的結(jié)果[19]。CGF中PDGF對中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等有趨化吸引作用并使成纖維細(xì)胞受到強(qiáng)力刺激以致增殖及誘導(dǎo)其合成膠原和纖維連接蛋白等成份，以形成肉芽組織促進(jìn)傷口愈合[18]；TGF-β也可以促進(jìn)膠原積聚和傷口中肉芽組織形成；此外，增強(qiáng)膠原基因的表達(dá)可通過TGF-β與基因調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合從而促進(jìn)膠原的積聚[20]。應(yīng)用外源性TGF-β可加強(qiáng)傷口的物理學(xué)成份提高傷口的張力和愈合率；FGF促進(jìn)癱痕形成的作用；EGF和IGF都是提高慢性皮膚傷口的愈合率和傷口愈合后的張力；VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長促進(jìn)傷口的血管化進(jìn)程[20]。CGF可以提供傷口早期愈合所需的多種生長因子，可以減少瘢痕形成，提高愈合質(zhì)量，值得在臨床上應(yīng)用[21]。

4.4 皮膚病

皮膚病是發(fā)生在皮膚和附屬皮膚臟器的總稱。隨著犬、貓伴侶動物數(shù)量的增多，皮膚病的感染也日趨增多。當(dāng)發(fā)生皮膚病時，針對不同的寄生蟲、真菌和細(xì)菌以及其他病菌皮膚病，一般首選抗生素類、抗真菌類和抗細(xì)菌類藥物，都具有很好的療效。有文獻(xiàn)研究CGF中TGF-β、VEGF和IGF對皮膚病有影響。銀屑病中IGF能調(diào)控鈣誘導(dǎo)的KCs分化相關(guān)的基因表達(dá)，參與表皮分層的異常，還參與了免疫機(jī)制的異常反應(yīng)[22]；銀屑病患者皮損中VEGF含量較正常人顯著提高，其可能是銀屑病血管異常生成的重要促進(jìn)因子[23]；銀屑病患者表皮的過度增殖可能是由于皮損處KC逃脫了TGF-β家族的配體和受體系統(tǒng)的抑制作用[24]。TGF-β在硬皮病皮膚硬化和光老化發(fā)揮著重要作用。TGF-β、VEGF、IGF對皮膚腫瘤也起著重要作用。可以進(jìn)一步深入研究臨床上CGF對犬貓皮膚病的影響，是否可以提高療效。

4.5 慢性骨關(guān)節(jié)炎

骨關(guān)節(jié)炎是一種退行性的臨床綜合征，是由多種原因造成關(guān)節(jié)軟骨破壞引起的并伴有疼痛及殘疾等癥狀的疾病[25]。發(fā)病率隨著年齡的增加而增加。一般治療方法有減肥（針對肥胖犬貓）、水療法、理療以及外科手術(shù)治療。其CGF中PDGF能顯著促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的有絲分裂進(jìn)而增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)移植區(qū)的毛細(xì)血管生長[26]。TGF-β可促進(jìn)成骨前體細(xì)胞的有絲分裂，進(jìn)而促進(jìn)骨細(xì)胞的生長發(fā)育[27]。IGF也可促進(jìn)成骨細(xì)胞的有絲分裂，此外還可促進(jìn)皮膚骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的生長發(fā)育[28]。VEGF可以促進(jìn)新生毛細(xì)血管形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，提高堿性磷酸酶的表達(dá)，增強(qiáng)血管的通透性從而促進(jìn)骨折愈合[29]。

4.6 神經(jīng)損傷

近年研究發(fā)現(xiàn)，在CGF所含有的生長因子中，IGF不僅對大腦發(fā)育有一定影響，而且可抑制細(xì)胞凋亡，對許多中樞疾病發(fā)揮著保護(hù)作用且有助于神經(jīng)細(xì)胞受損后的功能恢復(fù)[30]。VEGF對神經(jīng)也具有保護(hù)作用[31]。EGF與組織修復(fù)、腫瘤發(fā)生以及胚胎發(fā)育有密切關(guān)系，并且能強(qiáng)烈刺激細(xì)胞分裂。EGF通過與表皮生長因子受體（EGFR）高親和力結(jié)合發(fā)揮作用，對多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）受損如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、視神經(jīng)擠壓傷和脊髓損傷等均有一定的治療作用[32]。它可以營養(yǎng)髓鞘，減緩髓鞘脫失，對犬瘟熱腦炎疾病有一定治療作用[33]；促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化為神經(jīng)元，改善神經(jīng)元丟失，促進(jìn)CNS損傷后的功能修復(fù)。目前已經(jīng)在動物模型和細(xì)胞培養(yǎng)中得到證實(shí)，但將這些方法應(yīng)用于臨床治療仍需要進(jìn)行更深入的研究。TGF-β1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)生長、保護(hù)、外傷及炎癥等方面也發(fā)揮一定的作用[34]。這些研究為中樞系統(tǒng)疾病的治療提供了新的研究方向，但目前尚未明確相關(guān)作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)束語

目前，國內(nèi)外學(xué)者己開始將CGF纖維蛋白凝膠應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域，如人牙周組織手術(shù)、種植外科手術(shù)、軟組織整形手術(shù)以及犬貓骨折手術(shù)，骨關(guān)節(jié)炎恢復(fù)，軟組織損傷愈合，角膜損傷修復(fù)中，并取得了很好的效果。由于CGF具有完全來源于自體血液，無毒性，無免疫原性，且制備簡便，費(fèi)用低廉，不會發(fā)生交叉感染等優(yōu)點(diǎn)，其臨床應(yīng)用前景十分廣闊。但是，在國內(nèi)寵物（犬、貓、馬）臨床，CGF應(yīng)用的鮮見報道，鑒于其作用及特點(diǎn)，我們有理由期待CGF療法能夠發(fā)揮其應(yīng)有的作用，造福動物。

然而，CGF濃度是決定其作用發(fā)揮的關(guān)鍵因素。如何保障所制取的CGF制劑中相關(guān)生長因子的含量，除制備技術(shù)之外，自體生長因子水平的高低起決定性作用。中國傳統(tǒng)獸醫(yī)的針灸療法具有調(diào)節(jié)機(jī)體固有機(jī)能的作用，我們的前期研究表明，電針療法對多種神經(jīng)再生相關(guān)生長因子的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用[35]，通過針灸干預(yù)，有望提高相關(guān)生長因子的水平，從而有助于獲取更高質(zhì)量的CGF，保障其作用的發(fā)揮[36]。