新技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中的應(yīng)用

◎ 朱 群

（品升商品檢測(cè)（上海）有限公司，上海 201108）

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即為PCR技術(shù)，其主要原理是擴(kuò)增特定的DNA片段。美國(guó)學(xué)者最早提出和開(kāi)發(fā)利用該技術(shù)，之后慢慢在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中開(kāi)始運(yùn)用。實(shí)踐研究表明，該技術(shù)的運(yùn)用可以有效縮短食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間，食品微生物檢出率也可以得到大大提升，有效篩查致病微生物。

1 食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)的主要內(nèi)容

1.1 致病菌

蠟樣芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌等是引起食物中毒的主要致病菌。相關(guān)專(zhuān)家的實(shí)驗(yàn)研究表明，如果食品中的產(chǎn)氣莢膜桿菌含量過(guò)高，就會(huì)有食物中毒現(xiàn)象發(fā)生；如果食品中的蠟樣芽孢桿菌有過(guò)高含量，也會(huì)有食物中毒現(xiàn)象出現(xiàn)。根據(jù)這些研究表明，在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中，除了要識(shí)別危害有生物之外，還需要對(duì)致病菌的數(shù)量科學(xué)檢測(cè)[1]。

1.2 指示性菌種檢驗(yàn)

①對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)食品中菌落總數(shù)的檢測(cè)，可以判斷食品污染程度。在具體實(shí)踐中，需要取樣1 g左右的食品，然后對(duì)其中的菌落數(shù)量有效檢驗(yàn)。②檢測(cè)大腸菌群，在37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h，可產(chǎn)氣、產(chǎn)配以及革蘭氏染色陰性無(wú)芽孢桿菌[2]。

2 PCR技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 常規(guī)PCR檢測(cè)

常規(guī)PCR檢測(cè)的原理較為簡(jiǎn)單，將適量聚合酶加入到DNA模板和相應(yīng)引物的混合物中，催化之后，擴(kuò)增DNA片段，其經(jīng)歷周期較多，DNA模板發(fā)揮著重要的作用。且在每一個(gè)周期內(nèi)，都會(huì)有相應(yīng)的DNA片段產(chǎn)生，并且能直接將其作為循環(huán)模板使用，由此可知，在這個(gè)過(guò)程中，反應(yīng)產(chǎn)物會(huì)不斷增加。20世紀(jì)八九十年代，研究人員借助于沙門(mén)氏菌基因來(lái)設(shè)計(jì)引物，實(shí)驗(yàn)表明，運(yùn)用PCR技術(shù)可以有效檢測(cè)出多種菌類(lèi)，且有99.5%左右的檢出率，效果比較顯著，值得大力推廣和應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)。

2.2 多重PCR檢測(cè)

本檢測(cè)方法類(lèi)似于常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)，但也存在著一定差異，其需要將更多的引物加入到反應(yīng)體系之中。如果混合物中的引物存在著互補(bǔ)關(guān)系，就可以將差異化的DNA片段增設(shè)于反應(yīng)管中。實(shí)踐研究表明，多重PCR檢測(cè)技術(shù)不僅具有常規(guī)檢測(cè)方式的優(yōu)勢(shì)，還可以有效減少檢測(cè)步驟，預(yù)期檢測(cè)目標(biāo)順利實(shí)現(xiàn)。此外，多重PCR檢測(cè)技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，效率更高。但需要注意的是，多重PCR檢測(cè)技術(shù)也存在著一定的問(wèn)題，如檢測(cè)效率和敏感度較低等，需要在日后研究中加以革新。

很多學(xué)者都對(duì)多重PCR檢測(cè)技術(shù)的運(yùn)用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，其中經(jīng)常用到的有大腸類(lèi)細(xì)菌和沙門(mén)氏菌檢測(cè)。結(jié)果表明，在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中運(yùn)用多重PCR技術(shù)，檢測(cè)率超過(guò)60%，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 RT-PCR

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)即RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，其主要工作原理是提取細(xì)胞中的RNA，將其作為模板獲取cDNA，之后有效擴(kuò)增PCR。檢測(cè)實(shí)踐表明，RT-PCR技術(shù)具有較高的靈敏度，提升了樣品分析的精確度。有專(zhuān)家在河流樣品和動(dòng)物糞便檢測(cè)中采用了RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNA和RNA菌體之間存在有較大的差異，且兩種類(lèi)型的噬菌體也存在著不同。因此，檢測(cè)菌體時(shí)，可以極易分開(kāi)噬菌體的陰性和陽(yáng)性，在微生物檢測(cè)中可以發(fā)揮較大的價(jià)值。

3 PCR技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

3.1 操作難度較小

實(shí)踐研究表明，傳統(tǒng)自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，且檢測(cè)準(zhǔn)確性不高，微生物檢測(cè)工作效率得不到保證。因?yàn)槲⑸餀z測(cè)涉及較多方面的內(nèi)容，需要在不同項(xiàng)目一一檢測(cè)，如微生物成長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)溫度等，這樣就需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力，檢測(cè)環(huán)節(jié)較多，工作效率不高。而PCR技術(shù)屬于高自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)的范疇，通過(guò)應(yīng)用PCR技術(shù)，所有的檢測(cè)程序一個(gè)人就可以完成，人機(jī)一體化得到實(shí)現(xiàn)，檢測(cè)步驟得到簡(jiǎn)化，工作效率得到提升，對(duì)于我國(guó)現(xiàn)代食品行業(yè)的發(fā)展，也起到了有效的促進(jìn)作用[3]。

3.2 檢測(cè)快捷

傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)需要較長(zhǎng)的檢測(cè)周期，一般在2～4天，甚至還需要1周左右，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果還沒(méi)有出來(lái)，而食品已經(jīng)在市場(chǎng)流通，存在著嚴(yán)重的滯后性，不利于我國(guó)食品行業(yè)的整體發(fā)展。而PCR技術(shù)則有效地解決了這個(gè)問(wèn)題，檢測(cè)過(guò)程只需要幾個(gè)小時(shí)或者1天左右即可。

3.3 準(zhǔn)確率高

進(jìn)入新時(shí)期后，我國(guó)食品類(lèi)型日趨豐富，也出現(xiàn)了更多種類(lèi)的微生物，傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)在食品微生物分離方面就存在著較大難度，更別說(shuō)對(duì)食品微生物種類(lèi)有效辨別。其中，活性薄弱菌落的檢測(cè)是制約傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的一大關(guān)卡，檢測(cè)和培養(yǎng)難度較大，食品微生物檢測(cè)受到了影響。而通過(guò)PCR技術(shù)的運(yùn)用，則可以對(duì)食品微生物類(lèi)型有效檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，更好地開(kāi)展食品生產(chǎn)監(jiān)督工作，保證食品安全。

4 食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)的先進(jìn)技術(shù)

PCR技術(shù)屬于分子生物學(xué)的范疇，目前，還有其他的先進(jìn)檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)，如生理生化技術(shù)、免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)等。

4.1 生理生化技術(shù)

生理生化技術(shù)也被稱(chēng)為代謝學(xué)技術(shù)，其主要是借助于菌體代謝產(chǎn)物，來(lái)對(duì)菌種的情況進(jìn)行檢測(cè)。其中，廣泛運(yùn)用到的ATP生物發(fā)光法、微量生化法等都屬于生理生化技術(shù)。以ATP生物發(fā)光法為例，因?yàn)锳TP存在于所有的生物活體中，通過(guò)檢驗(yàn)樣品中的ATP濃度，就可以有效獲取其中的活菌數(shù)量；借助于光度計(jì)，來(lái)檢測(cè)熒光素的熒光強(qiáng)度，就可以對(duì)細(xì)菌數(shù)量有效確定。實(shí)踐研究表明，本技術(shù)可以節(jié)約時(shí)間，簡(jiǎn)捷性較好，因此得到了較為廣泛的運(yùn)用。另外一種方法是微量生化法，放射測(cè)量法、微熱量技法等都屬于微量生化法的范疇，前者主要是利用微量放射性標(biāo)記物標(biāo)記菌種生長(zhǎng)所需碳水化合物來(lái)有效檢測(cè)菌種生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的放射性二氧化碳，由此有效測(cè)定食品菌量；后者則是借助于菌生長(zhǎng)產(chǎn)熱變化情況來(lái)有效鑒別菌種。實(shí)踐研究表明，微量生化法在食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中具有較快的檢測(cè)速度和較高的準(zhǔn)確度，值得推廣和運(yùn)用。

4.2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

在食品生物檢驗(yàn)檢測(cè)中，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要利用的是抗原-抗體的特異性反應(yīng)，將微生物的特異基因表達(dá)產(chǎn)物作為作用對(duì)象。免疫磁性微球法是其重要代表技術(shù)，近些年來(lái)其逐漸發(fā)展起來(lái)，有效結(jié)合了免疫學(xué)的特異性和固化試劑的優(yōu)勢(shì)，能夠更加快速、高效地開(kāi)展食品檢驗(yàn)檢測(cè)工作?，F(xiàn)階段，在肉類(lèi)、水果、蔬菜等食品樣品的微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中已經(jīng)開(kāi)始廣泛應(yīng)用本技術(shù)。此外，酶聯(lián)免疫吸附法等也是免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要代表，本種技術(shù)的基礎(chǔ)為抗原及抗體反應(yīng)特異性結(jié)合高效的酶作用。實(shí)踐研究表明，采用酶聯(lián)免疫吸附法，可以定性定量檢測(cè)目標(biāo)微生物，效果突出。酶聯(lián)免疫吸附法又可以分為間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等多種類(lèi)型，不僅可以臨床診斷，還能夠測(cè)定小分子，被廣泛運(yùn)用到食品安全檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域內(nèi)。在乳制品的檢驗(yàn)檢測(cè)實(shí)踐中，還可以有機(jī)結(jié)合熒光分析法和酶聯(lián)免疫吸附法。實(shí)踐研究表明，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)效率較高，未來(lái)有很大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。

4.3 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)也被廣泛運(yùn)用到了食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)中，其主要技術(shù)基礎(chǔ)為蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)等。食品微生物檢驗(yàn)中，質(zhì)譜技術(shù)、核磁共振技術(shù)等得到了廣泛運(yùn)用，具有較大的發(fā)展?jié)摿?。其中，一般在海產(chǎn)品腐敗菌的檢驗(yàn)中較多的應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)方法，且能有效檢驗(yàn)檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性菌，具有不錯(cuò)的效果。根據(jù)相關(guān)研究，在亞種區(qū)分方面經(jīng)常會(huì)運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，但是工業(yè)快速檢驗(yàn)檢測(cè)需求無(wú)法滿(mǎn)足；針對(duì)這種情況，就需要積極應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)。實(shí)踐結(jié)果表明，通過(guò)科學(xué)運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)，可以更加快速、高效的檢驗(yàn)牛奶、水果、肉類(lèi)和蔬菜等食品菌種。

5 結(jié)語(yǔ)

食品安全問(wèn)題會(huì)直接影響到人們身體健康和生命安全，因此，就需要充分重視食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)工作。隨著時(shí)代的發(fā)展，目前出現(xiàn)了一大批新型檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)，如PCR技術(shù)。和傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)相比，這些新技術(shù)具有較大優(yōu)勢(shì)，節(jié)約時(shí)間，效率更高。但在未來(lái)發(fā)展中，依然要對(duì)各種檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)不斷創(chuàng)新和改良，以便更加及時(shí)和高效地開(kāi)展食品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)工作。