食品微生物檢測中PCR技術(shù)的應(yīng)用研究

◎ 王曉虹，程幫全

（浙江優(yōu)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311106）

PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在食品微生物檢測中的利用價(jià)值極高。近年來，該技術(shù)的使用范圍逐漸擴(kuò)大，并成為食品微生物檢測的重要手段。能夠有效提升微生物檢測的質(zhì)量與效率，為人們創(chuàng)造安全的食品使用環(huán)境。

1 PCR技術(shù)綜述

1971年，美國Khorana便已經(jīng)提出關(guān)于PCR技術(shù)的設(shè)想，但被認(rèn)為是妄想。經(jīng)過眾多年的努力與研究，1985年該技術(shù)正式登上歷史舞臺(tái)，被后人所熟知。該技術(shù)出現(xiàn)后便被利用在基因工程中，實(shí)現(xiàn)了食物微生物檢測的新升級(jí)。當(dāng)前，世界各國均努力將PCR技術(shù)應(yīng)用在食品微生物檢測中。通常，PRC技術(shù)的檢驗(yàn)流程為：溫度升至94 ℃變性，DNA雙鏈裂解成單鏈。再降低溫度，一般下調(diào)至55 ℃退火，再升到72 ℃延伸，再反復(fù)重復(fù)有關(guān)步驟，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的檢測。利用該技術(shù)可大大提升準(zhǔn)確度，并實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段進(jìn)行測序，確定微生物種類的基本目的[1]。

2 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的利用價(jià)值

PCR技術(shù)具有較大的應(yīng)用價(jià)值。①操作較為簡單，且對(duì)食品質(zhì)量不會(huì)產(chǎn)生影響，大大提升微生物檢測的效率。同時(shí)，其所使用的設(shè)備較少，在簡單的環(huán)境下便能夠完成對(duì)微生物的檢測工作。②PCR技術(shù)對(duì)食品微生物檢測的準(zhǔn)確率較高，在短時(shí)間內(nèi)便能夠確定食品中是否含有微生物，且該技術(shù)自動(dòng)化程度較高，較比傳統(tǒng)檢測方法而言更加精準(zhǔn)、高效。③該技術(shù)的發(fā)展空間較大，研究人員在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，能夠設(shè)計(jì)出更多的檢測方法，實(shí)現(xiàn)高效、快捷、準(zhǔn)確的食品微生物檢測方法，提升PCR技術(shù)的檢測能力，確保食品安全性，規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)。

3 PCR技術(shù)

3.1 技術(shù)原理

PCR技術(shù)的使用實(shí)現(xiàn)了快速檢測，在低成本基礎(chǔ)上，提升靈敏性，實(shí)現(xiàn)快捷操作。該技術(shù)原理為：DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化與傳代的重要途徑。雙鏈DNA在DNA聚合酶的作用下，可變性解旋成單鏈，并根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。因此，通過溫度的變化，控制DNA變性與復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物等，便可完成特定基因的體外復(fù)制。

3.2 PCR所需要的材料

該技術(shù)在使用過程中需要多種原料，隨著技術(shù)的進(jìn)步，在原有基礎(chǔ)上原料又有所增加。①特異性的引物，該引物需要工作人員提前準(zhǔn)備，并只能特異性擴(kuò)增目標(biāo)微生物的DNA片段。同時(shí)，該引物不應(yīng)過長，通常在15～20個(gè)堿基。特異性引物不可產(chǎn)生互補(bǔ)反應(yīng)。②DNA聚合酶。引物是一小段特定的DNA，與微生物DNA結(jié)合相對(duì)較為困難。因此，需要DNA聚合酶起到促進(jìn)作用，對(duì)引物與微生物DNA結(jié)合起到催化作用。③緩沖液。緩沖液常與DNA聚合酶一起使用，增強(qiáng)聚合酶活性，避免其受到外界因素的影響。在緩沖液的保護(hù)下，可促使引物與微生物之間發(fā)生聯(lián)系的概率進(jìn)一步提升。④Zn2+離子，增強(qiáng)聚合酶的活力。其濃度對(duì)PCR產(chǎn)物的數(shù)量起到一定影響，因此在檢測過程中需要對(duì)該離子濃度嚴(yán)格掌控，避免所測量的結(jié)果有偏差[2]。

4 PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

4.1 大腸桿菌的檢測

大腸桿菌具有一定毒素，且該毒素存在一致性，傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)無法精準(zhǔn)的檢測出來。而PCR技術(shù)運(yùn)用特殊方式，可實(shí)現(xiàn)對(duì)該微生物的檢測。也有研究人員利用免疫磁分離技術(shù)在牛肉中檢測到了大腸桿菌，并利用stx1、stx2、hly等基因分析了大腸桿菌的類型?？傊?，較比血清法檢測，多重PCR技術(shù)的檢測方式更加靈敏、精準(zhǔn)。

4.2 沙門氏菌

食品在制作加工過程對(duì)沙門氏菌造成一定影響，會(huì)降低其含量，因此該類型微生物在食品中的含量較低，也正因此，對(duì)食品微生物檢測的結(jié)果將造成一定影響。通常使用invA、B、C、E等特異引物，來構(gòu)建多重PCR。檢測結(jié)果顯示，單一的PCR與二重PCR檢測結(jié)果基本沒有差異，但利用三重PCR檢測的結(jié)果將更加精準(zhǔn)。眾多研究人員在試驗(yàn)中，利用特異性引物，在凍家禽肉中檢測到了沙門氏菌，并判斷出其中血清的流行情況[3]。

4.3 乳酸菌中的微生物檢測

當(dāng)前，大部分乳酸菌為有益菌，可實(shí)現(xiàn)人體腸道功能的改善、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)等。但少部分乳酸菌對(duì)人體會(huì)造成一定傷害，因此在購買過程中需要對(duì)乳酸菌著重關(guān)注，這也要求工作人員對(duì)乳酸菌的檢測更加仔細(xì)。我國對(duì)乳酸菌的檢測工作開始時(shí)間較早，研究人員發(fā)現(xiàn)乳酸菌DNA序列中，1414～1432位置上的堿基具有代表性，且具有普遍性。因此，對(duì)當(dāng)前乳酸菌的檢測主要針對(duì)該位置上的堿基進(jìn)行排列，判斷乳酸菌性質(zhì)。當(dāng)前普遍采用SDS方法對(duì)乳酸菌進(jìn)行細(xì)胞分裂，繼而利用蛋白酶去掉其中蛋白質(zhì)，再將提前準(zhǔn)備好的引物與其結(jié)合，完成實(shí)驗(yàn)研究。由于該片段僅存在于乳酸菌上，因此不會(huì)擔(dān)心引物與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，以此便輕松地實(shí)現(xiàn)對(duì)乳酸菌含量的檢測。

4.4 對(duì)啤酒中微生物的檢測

隨著生活質(zhì)量的提升，啤酒成為人們生活中常見的食品。我國啤酒種類多、產(chǎn)量大，其微生物檢測相對(duì)存在一定復(fù)雜性特點(diǎn)。根據(jù)啤酒的制作方法可知，啤酒由發(fā)酵得來，且其中最重要的微生物便是乳酸桿菌。啤酒原料中含有異維A酸，具有抑菌作用，但由于乳酸桿菌的特殊性，對(duì)異維A酸將造成一定影響。有研究表示，啤酒的腐敗與乳酸桿菌具有密切聯(lián)系。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，軟桿菌能夠?qū)Ξ惥SA酸起到一定抑制作用。日本的科研人員對(duì)horA基因的順序進(jìn)行了研究，合成特異引物，并利用聚合酶與乳桿菌的提取液，利用電泳對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行檢測，得到了十分接近的結(jié)果。以此，啤酒中腐敗菌檢測的手段被研發(fā)出來，并在時(shí)間上具有強(qiáng)大優(yōu)勢，僅需要6 h。

4.5 對(duì)致病菌的檢測

食品中存在的致病菌對(duì)人體將造成較大的危害，甚至引發(fā)疾病，包括衣原體、支原體、病毒等。為給人們創(chuàng)造健康的飲食環(huán)境，需要將致病菌控制在合理范圍內(nèi)，并進(jìn)行嚴(yán)格的檢測。因此，采用PCR技術(shù)，將致病菌樣本提前準(zhǔn)備，并利用高速離心的方式將致病菌分離。在一定溫度條件下，其將發(fā)生裂解，工作人員在其裂解過程中得到核酸。再將致病菌的DNA加以分析，得到具有代表性的片段。在確定片段后，將特異引物與之結(jié)合，最后得到致病菌DNA序列。在該工作中判斷其是否具有之前選好的靶DNA片段，繼而得出其是否為該致病菌細(xì)胞。經(jīng)過多次試驗(yàn)，PCR技術(shù)在該類微生物檢測過程中具有較強(qiáng)的優(yōu)勢，時(shí)間短、見效快。

5 展望

按照實(shí)際特定選擇特異引物，使用專業(yè)的手段對(duì)DNA進(jìn)行檢測，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品微生物的檢測目的[4]。經(jīng)過一系列流程，可對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等眾多微生物進(jìn)行檢測，效率較高、時(shí)間較短?？梢?，PCR技術(shù)在微生物檢測中占據(jù)重要地位。在未來的發(fā)展中將進(jìn)一步提升PCR的研究水平，縮短時(shí)間。傳統(tǒng)微生物檢測需要2～5天，但PCR技術(shù)通常為幾個(gè)小時(shí)，最長不會(huì)超過一天。在不斷的研究過程中，可進(jìn)一步縮短時(shí)間，提升檢測效率。與此同時(shí)，需要進(jìn)一步研究該技術(shù)的特異引物，增加原料的使用。促使其在使用過程中，對(duì)食品微生物檢測精準(zhǔn)度進(jìn)一步提升，強(qiáng)化我國食品行業(yè)的發(fā)展，以及科技運(yùn)用能力。

6 結(jié)論

本文闡述了PCR技術(shù)，并針對(duì)其的實(shí)際應(yīng)用加以分析。得出其在各種微生物檢測中的重要作用。其中，多重PCR技術(shù)的使用可在一定程度上提升該技術(shù)的結(jié)果精準(zhǔn)度。同時(shí)，熒光探針定量技術(shù)、變性梯度凝膠電泳等技術(shù)的綜合利用，也將進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)食品微生物檢測的靈敏度，并實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的、大量的微生物檢測。