建立大鼠心臟死亡供體原位肝移植模型方法的研究進(jìn)展

武睿超，黃兆宇，張 黎，劉鈞漢，鄭克譜，冉江華

(昆明市第一人民醫(yī)院肝膽胰血管外科,云南 昆明 650500)

肝臟移植手術(shù)是終末期肝病患者唯一有效的治療措施。然而供體短缺已經(jīng)成為了制約肝臟移植發(fā)展的瓶頸[1]。在這樣的環(huán)境下，心臟死亡供體(donation after cardiac death，DCD)成為了獲取人體器官的重要途徑，也緩解了供肝短缺的問題。由于DCD通常都會(huì)經(jīng)歷一定時(shí)間的低血壓及低氧飽和度，隨之而來的便是延長的熱缺血時(shí)間對移植物功能的影響。熱缺血時(shí)間是衡量熱缺血損傷最直接的標(biāo)志，熱缺血時(shí)間延長會(huì)繼發(fā)術(shù)后原發(fā)性移植物無功能和膽道狹窄等并發(fā)癥[2]， 增加了患者接受DCD 肝移植術(shù)后的風(fēng)險(xiǎn)。因此，研究DCD肝移植的相關(guān)問題具有重要的現(xiàn)實(shí)臨床意義和價(jià)值。而建立穩(wěn)定的大鼠DCD原位肝移植模型是研究DCD肝移植的基礎(chǔ)。目前關(guān)于大鼠原位肝移植模型的研究很多，但關(guān)于大鼠DCD原位肝移植模型的研究卻很少，且大鼠DCD原位肝移植的建立，步驟多，操作復(fù)雜，難度較大。該文就建立穩(wěn)定的大鼠DCD原位肝移植模型的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行綜述。

1 大鼠

用于研究DCD肝移植的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，各項(xiàng)條件與人類最相近的是恒河猴，但考慮到其高昂的價(jià)格，運(yùn)用較少。一些研究也用豬、兔、狗和豚鼠做原位肝移植的研究，相比之下，選用大鼠建立原位肝移植模型更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可重復(fù)性強(qiáng)，技術(shù)更成熟。一般選擇體重為250～300 g的雄性SD大鼠或者Wistar大鼠，這兩個(gè)品種的大鼠生長發(fā)育快，抗病能力強(qiáng)，自發(fā)腫瘤率低，對性激素感受性高。也有使用近交系的Lewis大鼠，相比前兩者，Lewis大鼠排斥反應(yīng)弱，但抗病、抗感染能力較弱，也更貴。若研究急性免疫排斥，國際上公認(rèn)的鼠種配對方式為型 DA 至Lewis 大鼠、DA 至 Brown Norway大鼠及 Brown Norway至 Lewis 大鼠，國內(nèi)由于上述鼠種缺乏及技術(shù)操作尚待改善，目前較多應(yīng)用的鼠種配對方式 Wistar 至 SD大鼠， Lewis 至 Wistar 或者SD大鼠至Lewis大鼠[3]。

2 手術(shù)麻醉

文獻(xiàn)中建立大鼠DCD肝移植模型常用的麻醉方法有水合氯醛、戊巴比妥注射麻醉，乙醚吸入麻醉。戊巴比妥鈉和水合氯醛對動(dòng)物的體溫、呼吸、心率均有一定程度的抑制，但水合氯醛對動(dòng)物呼吸頻率、體溫及心率的影響較小。大鼠DCD肝移植外科操作復(fù)雜，時(shí)間要求較長，水合氯醛腹腔注射是很好的選擇，其誘導(dǎo)時(shí)間短，維持時(shí)間長，價(jià)格低廉，較易獲得，麻醉過程中動(dòng)物痛苦較輕，蘇醒期較平穩(wěn)，安全性好[4]。也可選擇間斷注射麻醉[5]，即術(shù)前間斷小劑量給藥直至達(dá)到麻醉狀態(tài)立即停藥，術(shù)中根據(jù)手術(shù)時(shí)間和大鼠麻醉深度給予補(bǔ)充注射麻藥。該方法可避免部分對麻醉藥物敏感的大鼠因常規(guī)劑量的注射而造成的死亡，降低動(dòng)物的麻醉死亡率。戊巴比妥鈉麻醉后恢復(fù)期長，恢復(fù)期過長可導(dǎo)致大鼠術(shù)后死亡，而且其具有肝毒性，不建議使用。乙醚吸入麻醉簡單易行，誘導(dǎo)期短，可根據(jù)大鼠的呼吸頻率、深度等隨時(shí)調(diào)整吸入劑量，根據(jù)手術(shù)時(shí)間的長短調(diào)整麻醉時(shí)間，且撤出麻醉迅速，術(shù)后較易蘇醒，而且對肝功能、生理影響較小,無肝期開始后死亡率低。受體手術(shù)中進(jìn)入無肝期以后動(dòng)物有一種類似于“休眠樣”的狀態(tài)，在完成肝移植開通肝血流后,這種狀態(tài)還能維持10 min左右[6]，乙醚麻醉則可在進(jìn)入無肝期后撤除麻醉，防止麻醉過深術(shù)中出現(xiàn)呼吸心跳驟?；蛘咝g(shù)后蘇醒困難。乙醚和水合氯醛的缺點(diǎn)是會(huì)導(dǎo)致呼吸道分泌物較多，術(shù)前給大鼠注射阿托品后呼吸道分泌物明顯減少，可避免呼吸不暢導(dǎo)致的術(shù)中和術(shù)后并發(fā)癥。DCD的供肝較無DCD的供肝損傷重，移植肝復(fù)通血流后恢復(fù)功能較慢、較差，術(shù)后轉(zhuǎn)醒時(shí)間也較長，有條件可給予吸氧。麻醉時(shí)應(yīng)適當(dāng)減少麻藥劑量，在開通肝血流后出現(xiàn)大鼠蘇醒過早，可用小劑量乙醚吸入補(bǔ)充麻醉。

3 術(shù)前準(zhǔn)備

供體術(shù)前不禁飲食，可根據(jù)需要于術(shù)前5～10 min靜脈注射肝素，由于大鼠肝臟經(jīng)歷了一段時(shí)間的血流中斷，肝臟血管易形成凝血，血栓栓塞，影響灌注效果，術(shù)前供體全身肝素化有利于DCD供肝的保護(hù)。也有實(shí)驗(yàn)的模型為了更接近臨床DCD肝移植，術(shù)前不使用肝素。

受體術(shù)前禁食6～8 h，期間可給予糖水供能，禁水2 h，以保證其胃部空虛，防止嘔吐及誤吸，提高手術(shù)的安全性，也利于術(shù)中視野的清晰暴露。若選擇水合氯醛或乙醚麻醉，受體術(shù)前30 min 皮下注射硫酸阿托品減少呼吸道分泌物。供體術(shù)前給予抗生素和糖皮質(zhì)激素能顯著提高移植成功率和術(shù)后生存率[7]。臨床肝移植中，免疫抑制治療和抗感染治療是重要的組成部分。糖皮質(zhì)激素作為最早使用的免疫抑制劑，曾經(jīng)扮演著不可或缺的角色，糖皮質(zhì)激素具有抗炎、免疫抑制、抗微生物毒素和抗休克作用，在大鼠肝移植手術(shù)中使用可增強(qiáng)手術(shù)耐受力和術(shù)后生存率。激素免疫抑制治療相比于非激素免疫抑制方案而言，其最大的弊端是免疫力下降，感染發(fā)生率增加[8]。加之動(dòng)物手術(shù)很難做到完全無菌操作，供體術(shù)前給予注抗生素抗感染很重要。

4 熱缺血時(shí)間

目前普遍認(rèn)為肝臟安全承受熱缺血時(shí)間的上限為30min。在大鼠DCD肝移植模型中，熱缺血30min內(nèi)肝損傷可逆，并逐漸恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)和功能，移植物存活率無明顯差異[9]。熱缺血延長到45 min時(shí)微循環(huán)功能還可耐受，熱缺血60min時(shí)微循環(huán)出現(xiàn)不可逆功能障礙[10]。超過30 min熱缺血，則可能導(dǎo)致肝臟微循環(huán)障礙、PNF、膽道缺血性損傷等并發(fā)癥發(fā)生率顯著增高，移植成功率大大降低。在模型建立時(shí)，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的熱缺血時(shí)間。Monbaliu D等[11]發(fā)現(xiàn)在大動(dòng)物DCD模型中，在熱缺血60min后通過常溫體外機(jī)械灌注取代4h的冷缺血時(shí)間，可明顯減少移植物原發(fā)性無功能的發(fā)生率。若具備常溫機(jī)械灌注設(shè)備，可延長模型熱缺血時(shí)間。

5 保存液

DCD肝臟遭受更為嚴(yán)重的熱缺血損傷，從而易引起移植后移植物功能延遲恢復(fù)、移植物原發(fā)性無功能、微循環(huán)障礙和膽管性病變。供肝的灌注和保存效果直接影響供肝的質(zhì)量。而供肝質(zhì)量直接關(guān)系到模型建立是否成功和術(shù)后存活率。選擇保存液顯得十分重要，器官保存液應(yīng)具有降低移植物水腫、細(xì)胞內(nèi)酸中毒、氧自由基以及提供能量底物的功效。威斯康星大學(xué)保存液(University of Wisconsin solution,UW)、組氨酸-色氨酸-酮戊二 酸鹽液(Histidine Tryptophan Ketoglutarate solution,HTK)是目前國際上應(yīng)用最廣泛的冷保存液，動(dòng)物模型中也經(jīng)常使用，但二者的保存效果目前仍然存在爭議。UW是目前供肝灌注及冷保存的金標(biāo)準(zhǔn)保存液，但對于DCD供肝而言，熱缺血時(shí)間的延長可導(dǎo)致肝竇狀隙和微循環(huán)灌注不足，高鉀及高黏度的UW可使遭受冷熱缺血損傷的肝臟微灌注不良進(jìn)一步加重，可能損傷內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致血管收縮，供肝灌注不均勻。李濤等發(fā)現(xiàn)在冷保存 8h 的條件下HTK對大鼠DCD供肝的保存效果優(yōu)于UW，可能與其更好的灌注并減少內(nèi)皮細(xì)胞與 Kuuffer細(xì)胞的激活有關(guān)，但延長冷保存時(shí)間后，HTK的優(yōu)勢消失[12]。Juang SE 等[13]發(fā)現(xiàn)，UW雖含有較高的鉀，但在活體肝移植中對血清鉀含量的變化無負(fù)面影響，HTK和UW液都能使患者血鉀維持在正常范圍。Stewart ZA.等[14]的研究發(fā)現(xiàn)HTK保存與DCD供肝移植物存活率下降有關(guān)，尤其是冷缺血時(shí)間>8 h的移植。Mangus RS等[15]則發(fā)現(xiàn)兩種溶液對供肝短時(shí)間的保存效果相似，肝移植術(shù)后生存率無明顯差異，但HTK對于膽道的保護(hù)優(yōu)于UW，且HTK的價(jià)格相對更低。其他保存液如Collins液, Institute georges lopez 1 液，Leeds solution、Polysol液和Celsior液等偶爾也有用于動(dòng)物模型。乳酸鈉林格氏液和生理鹽水因?yàn)閮r(jià)格便宜，容易獲得被國內(nèi)很多研究廣泛使用，但其降低移植物水腫、細(xì)胞內(nèi)酸中毒、氧自由基以及提供能量底物的功效差，不能長期保存供肝。所以若選擇乳酸林格氏液作為保存液，應(yīng)盡量縮短冷缺血時(shí)間。此外保存液中加入肝素、糖皮質(zhì)激素、葡萄糖酸鹽、抗生素、碳酸氫鈉、全氟碳化物、血管活性藥物和充氧等可以增加建模成功率[16-20]。

6 灌洗保存方式

模型灌洗主要采用物理灌洗[21]，即待到設(shè)定的熱缺血時(shí)間時(shí)，自灌洗流入道主動(dòng)脈或者門靜脈進(jìn)行穿刺，也有采用主動(dòng)脈門靜脈雙重穿刺，同時(shí)剪開肝上下腔靜脈胸段作為流出道，0～4℃保存液開始灌洗。自主動(dòng)脈灌洗操作簡單，容易控制，被較為廣泛地運(yùn)用。灌洗速度控制在3～4 ml/min,灌洗壓力不可過大，防止造成肝水腫，肝血竇結(jié)構(gòu)破壞。持續(xù)灌洗至肝臟顏色黃白、質(zhì)地均勻。

保存方式目前有靜態(tài)冷保存(Static cold storage，SCS)和機(jī)械灌注(Machine perfusion，MP)兩種方式。SCS是模型目前肝臟保存應(yīng)用最廣泛的方法，即使用0～4℃保存液浸泡保存即可，具有設(shè)備簡單，操作便捷，價(jià)格低廉等特點(diǎn)。但也有一定的劣勢應(yīng)予以重視，如SCS過程中會(huì)導(dǎo)致肝臟血管張力改變、肝竇內(nèi)皮損傷，細(xì)胞水腫、酸中毒等損傷，過長冷保存可以引起膽道并發(fā)癥、移植物肝功能恢復(fù)延遲或者失功能甚至受體死亡[22]。若模型需要模擬臨床上供肝存在保存運(yùn)輸?shù)睦淙毖獣r(shí)間，理論上UW液可保存供肝20～24h，但SCS過程中存在冷保存損傷。模型中SCS理想的供肝冷保存時(shí)間不超過8h，保存時(shí)限一般不超過12～15 h[23]。不同于 SCS，機(jī)械灌注技術(shù)通過連續(xù)動(dòng)態(tài)灌注保存液，實(shí)時(shí)監(jiān)控血管阻力、灌注壓、灌注液生化指標(biāo)等參數(shù)來動(dòng)態(tài)評估肝臟活力的同時(shí)，輸送養(yǎng)分供給，保證肝細(xì)胞的正常生理代謝，能夠減少低溫、缺氧對肝細(xì)胞的損傷。持續(xù)灌注能夠有效減少代謝廢物在肝臟的堆積，減輕肝細(xì)胞遭受毒性損害等,實(shí)現(xiàn)肝臟保存與修復(fù)，顯著降低移植后移植物功能延遲恢復(fù)和移植物原發(fā)性無功能的發(fā)生率[24]。使用機(jī)械灌注可延長肝臟的保存時(shí)限，并且恢復(fù)經(jīng)過熱缺血損傷的肝臟的部分功能，有助于提高模型建立成功率。但機(jī)械灌注受壓力、灌流速度、氧合情況等參數(shù)綜合影響，且設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，使用較少。

機(jī)械灌注根據(jù)灌注過程中維持溫度不同又可以分為低溫機(jī)械灌注(4℃ ～6℃)、亞低溫機(jī)械灌注(20℃)和常溫機(jī)械灌注(32℃～37℃)[23]。目前關(guān)于灌注溫度選擇存在爭議。低溫機(jī)械灌注可以降低器官代謝速率，降低缺血損害。一些研究[25-26]報(bào)道了低溫機(jī)械灌注在 DCD供肝中的保護(hù)性作用。其核心技術(shù)在于壓力控制，而非流量控制，因?yàn)榈蜏丨h(huán)境下，微循環(huán)毛細(xì)血管床收縮，較高壓力波動(dòng)直接損害器官[27-28]。Bruinsma BG等[29]的實(shí)驗(yàn)則論證了亞低溫機(jī)械灌注對肝臟保存效果的優(yōu)越性。與此同時(shí)，也有大量研究支持常溫機(jī)械灌注提供最接近生理狀態(tài)的局部環(huán)境，能更好地保存和修復(fù)肝臟功能，延長熱缺血耐受時(shí)限，將供肝原發(fā)性無功的風(fēng)險(xiǎn)降至最低，有效提高利用率[30-32]。而且對于DCD供體而言，膽道并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較高[33]，Op den Dries S等[34]分別使用常溫機(jī)械灌注及SCS，保存大鼠DCD供肝及非DCD供肝3h，結(jié)果證實(shí)，常溫機(jī)械灌注在DCD供肝中能減少膽道損傷。

7 手術(shù)操作

目前大鼠原位肝移植的手術(shù)方法最成熟也最經(jīng)典的是Kamada N等[35]創(chuàng)建的“二袖套法”[36]，即肝上下腔靜脈用縫合法吻合，門靜脈和肝下下腔靜脈用袖套法吻合,膽總管采用單管內(nèi)支架膽管。縮短無肝期是建立大鼠原位肝移植模型成功的關(guān)鍵[37-38]，該方法快速重建門靜脈以及肝下下腔靜脈，將無肝期縮短到15～20 min，術(shù)后存活也得到了提高。但是，這種方法仍需縫合肝上下腔靜脈，需要一定的外科基礎(chǔ)，掌握袖套技術(shù)也需要一定的時(shí)間。Miyata M等[39]的“三袖套法”，即在二袖套法的基礎(chǔ)上將肝上下腔靜脈改為袖套法吻合，使無肝期縮短。然而，這種方法容易出現(xiàn)肝上下腔靜脈扭曲以及錯(cuò)位，造成肝上下腔梗阻。Engemann R等[40]發(fā)展完善了吻合肝動(dòng)脈的大鼠肝移植模型，吻合肝動(dòng)脈更符合生理要求，能有效地降低膽瘺、膽道梗阻等并發(fā)癥，但無肝期較前二者延長。近年來，有研究者在二袖套法的基礎(chǔ)上，運(yùn)用磁環(huán)的磁力、三維空間自動(dòng)重合特性將供受體的肝上下腔靜脈對合[41]。這種方法可以縮短無肝期，降低手術(shù)難度，并且保持肝上下腔靜脈較高的通暢率，改善組織的愈合，提高大鼠肝移植模型術(shù)后存活率。手術(shù)操作的關(guān)鍵在于簡化操作，縮短無肝期，無肝期不應(yīng)超過26min[35]。后續(xù)關(guān)于大鼠原位肝移植模型的研究多是在以上手術(shù)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良完善。大鼠DCD原位肝移植模型還需要在大鼠原位肝移植模型的基礎(chǔ)上模擬DCD供肝熱缺血過程。目前臨床上熱缺血時(shí)間普遍定義為功能學(xué)熱缺血[收縮壓持續(xù)(至少2 min)低于50 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，10 mm Hg或血紅蛋白氧飽和度低于70%]開始直至冷保存液開始灌洗的時(shí)間間隔[23]。目前大鼠模型制造熱缺血，原理在于阻斷肝臟血流。具體方法有用血管鉗夾閉供體大鼠心臟基底部致使心臟停搏或者阻斷胸主動(dòng)脈和膈上下腔靜脈，有的實(shí)驗(yàn)中還會(huì)同時(shí)切斷供體大鼠氣管。受體大鼠手術(shù)中還應(yīng)注意盡量縮短手術(shù)時(shí)間，減少手術(shù)損傷和出血。

8 術(shù)后監(jiān)護(hù)

經(jīng)歷熱缺血的原位肝移植的大鼠較無熱缺血原位肝移植的大鼠肝功能差，模型建立是否成功，術(shù)后的監(jiān)護(hù)仍然很重要[21]。首先可根據(jù)陰莖背靜脈充盈程度給予適量補(bǔ)液，補(bǔ)充的液體可加入少量碳酸氫鈉以糾正酸中毒，補(bǔ)液宜適量，注射速度緩慢，防止發(fā)生充血性心力衰竭和肺水腫。術(shù)后應(yīng)注意給大鼠復(fù)溫保暖，防止低體溫引起死亡。連續(xù)吸入氧氣可促進(jìn)麻醉清醒，等其完全清醒并可以照?；顒?dòng)后，置入單籠喂養(yǎng)1 d，當(dāng)日飲用葡萄糖。次日標(biāo)記后與其他動(dòng)物合籠，正常飲食。術(shù)后前3天可予注射糖皮質(zhì)激素和抗生素。若要采血檢測，則需進(jìn)行采血后補(bǔ)液。

綜上所述，在大鼠DCD原位肝移植模型的建立中，存在熱缺血損傷供肝的質(zhì)量好壞是模型建立成功與否的關(guān)鍵。需要研究者特別注意選擇與自己研究合適的熱缺血時(shí)間，在供肝灌洗和保存中盡量維護(hù)肝臟功能。模型建立的難點(diǎn)在于手術(shù)操作，需要研究者長周期的手術(shù)訓(xùn)練，盡量縮短無肝期，能提高術(shù)后存活率。而大鼠、手術(shù)麻醉、術(shù)前準(zhǔn)備、術(shù)后監(jiān)護(hù)等環(huán)節(jié)的選擇和處理也都關(guān)系到大鼠DCD原位肝移植模型是否能成功建立，需予以重視。進(jìn)一步的研究需要關(guān)注灌注液開發(fā)、供肝保存方式，手術(shù)操作等核心的、有爭議的問題，為推進(jìn)大鼠心臟死亡供體原位肝移植的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和優(yōu)化方案。

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