植物油DNA提取和基因檢測(cè)的研究進(jìn)展

◎ 李曉萌

（沈陽食品檢驗(yàn)所微生物檢驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110000）

植物油屬于酯類物質(zhì)，主要由高級(jí)脂肪酸、甘油組成，常溫狀態(tài)為液態(tài)。植物油在人們生活中占據(jù)著不可替代的位置，而當(dāng)今市場(chǎng)上植物油摻假、轉(zhuǎn)基因植物油標(biāo)識(shí)混亂的情況，極大地影響了消費(fèi)者權(quán)益，同時(shí)也威脅到了人們的身體健康[1]。為此，需要采取有效措施了解植物油轉(zhuǎn)基因成分及真實(shí)性，常規(guī)方法主要包括儀器分析、理化分析等，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，也可以此為基礎(chǔ)，采取新的基因檢測(cè)方法。DNA熱穩(wěn)定性、酸堿耐受性良好，為分子生物學(xué)檢測(cè)提供了可能。

1 植物油DNA提取

1.1 提取步驟

植物油DNA提取中，主要步驟包括裂解、純化等。通過裂解將DNA在裂解體系中釋放，通過純化使有利DNA和裂解體系中鹽、多糖、蛋白質(zhì)等其他成分進(jìn)一步去除分離[2]。在裂解過程中，可以采用機(jī)械裂解、酶裂解、化學(xué)裂解等方法。純化當(dāng)中，使用氯仿、酚等作為有機(jī)溶劑，經(jīng)過抽提后將DNA沉淀出，使用磁珠、吸附樹脂等吸附DNA，然后將DNA洗脫。在DNA提取的不同方法中，主要差異存在于裂解、純化等過程，可以對(duì)裂解、純化方法加以優(yōu)化，進(jìn)而使植物油DNA提取效率提升。不同于其他物質(zhì)，植物油屬于高度深加工純化產(chǎn)品，含有較高的油脂類物質(zhì)，嚴(yán)重破壞DNA，并大幅降低含量。所以，植物油DNA提取中，使用乳化法等方法在裂解前需要做好前處理，將其中油類物質(zhì)去除，將更多殘留DNA分離出。

1.2 提取方法

植物油DNA提取中，常用方法包括十二烷基磺酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。SDS是一種陰離子去污劑，可在高溫下，促使細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)變性，結(jié)合蛋白質(zhì)、糖類等形成多重物，分離DNA和其他成分?？商嵘}濃度，降低溫度，以降低SDS多重物溶解度，沉淀多糖、蛋白質(zhì)，進(jìn)而純化DNA。SDS方法是當(dāng)前提取DNA常用的方法之一，操作簡(jiǎn)單，成本較低，提取DNA完整性較好。CTAB是一種陽離子去污劑，也可和DNA形成多重物。在高鹽濃度下，多重物溶解，低鹽濃度下，溶解度降低，產(chǎn)生沉淀，多糖、蛋白質(zhì)仍在溶液中溶解，采取離心操作，分離多糖、蛋白質(zhì)與DNA多重物，進(jìn)而純化DNA，將CTAB去除得到DNA[3]。CTAB在裂解液中作為主要成分，能夠?qū)?xì)胞裂解，并將雜質(zhì)成分去除。對(duì)裂解液成分優(yōu)化，能夠提高植物油DNA提取效率。

2 植物油基因檢測(cè)

2.1 普通PCR法

PCR即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠在體外擴(kuò)增微量特定DNA片段。常規(guī)PCR檢測(cè)中，包括PCR擴(kuò)增、電泳分析等流程，在食物有轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)，摻假檢測(cè)中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。例如，相關(guān)研究中采用PCR法對(duì)市面上10種精煉大豆油DNA進(jìn)行檢測(cè)，得出結(jié)果和樣品標(biāo)識(shí)相同。對(duì)2種大豆油DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因而大豆內(nèi)源基因中，都產(chǎn)生了擴(kuò)增條帶，符合產(chǎn)品標(biāo)識(shí)，證明PCR可以對(duì)植物油外源基因加以檢測(cè)[4]。普通PCR方法成本低、效率高，對(duì)儀器沒有太高要求，但在目標(biāo)基因擴(kuò)增后，需要采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，由于檢測(cè)樣品中，DNA含量通常較低，條帶亮度不足，對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生影響。同時(shí)，電泳操作中使用有毒試劑，可能危害人體健康，因而該方法實(shí)際應(yīng)用有所限制。

2.2 多重巢式PCR法

巢式PCR方法，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的變異形式，對(duì)完整片段擴(kuò)增，運(yùn)用了2對(duì)PCR引物。其中，第一對(duì)引物擴(kuò)增片段，類似于普通PCR，第二對(duì)引物，叫做巢式引物，在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部結(jié)合，進(jìn)而相比第一次擴(kuò)增，縮短第二次PCR擴(kuò)增片段。在第一次擴(kuò)增形成錯(cuò)誤片段后，第二次就幾乎不會(huì)在錯(cuò)誤片段擴(kuò)增。這種方法在應(yīng)用中，極大地提高了擴(kuò)增的靈敏度、特異性。在多重PCR方法中，能夠同時(shí)對(duì)不同位點(diǎn)基因擴(kuò)增，進(jìn)而提升基因檢測(cè)效率。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，是對(duì)普通PCR方法加以改進(jìn)，將熒光基團(tuán)加入反應(yīng)體系，通過積累熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)進(jìn)程。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量檢測(cè)位置模板。在相關(guān)研究中，對(duì)市面上出售的品牌大豆油DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均呈陽性，符合產(chǎn)品標(biāo)識(shí)。還有研究中，也選擇了10種植物油，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)，結(jié)果表明6種植物油擴(kuò)增結(jié)果為陽性，符合產(chǎn)品標(biāo)識(shí)[5]。另外，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)花生油、棕櫚油、大豆油混合植物油，結(jié)果證實(shí)能夠?qū)χ参飪?nèi)源基因進(jìn)行檢測(cè)。在植物油基因檢測(cè)中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，特異性強(qiáng)、靈敏度高、再現(xiàn)性好，相比于普通PCR方法，減少了瓊脂糖凝膠電泳鑒定的過程，避免了交叉污染，但對(duì)儀器條件提出更高要求。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是一種DNA擴(kuò)增處理的新型方法，可以6個(gè)靶基因區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)，分別對(duì)4種特異引物加以設(shè)計(jì)?；阪溨脫QDNA聚合酶作用，60～65 ℃恒溫條件下，對(duì)DNA片段恒溫?cái)U(kuò)增。在實(shí)際檢測(cè)中，有恒溫?cái)U(kuò)增操作、產(chǎn)物檢測(cè)操作等流程。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是DNA恒溫?cái)U(kuò)增的重要方法，擴(kuò)增過程一般在恒溫水浴鍋當(dāng)中進(jìn)行。在恒溫條件下，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法和普通PCR方法相比，能夠提升2～5個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，該方法對(duì)儀器條件要求不高，具有較強(qiáng)的特異性，操作比較簡(jiǎn)便，檢測(cè)成本可控，判斷結(jié)果難度較低。但在該方法的實(shí)際應(yīng)用中，引物設(shè)計(jì)難度通常較大，復(fù)雜度較高。在擴(kuò)增產(chǎn)物處理中，可能導(dǎo)致DNA污染的情況。另外，檢測(cè)中也有一定機(jī)率出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，需要加以注意。

3 結(jié)語

在植物油質(zhì)量檢測(cè)中，DNA提取質(zhì)量將對(duì)基因檢測(cè)效率產(chǎn)生直接影響?；谥参镉椭蠨NA含量少、完整度低的特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)方法加以改進(jìn)，采取新的DNA提取方法，提升DNA純度。進(jìn)而采用改進(jìn)PCR方法進(jìn)行基因檢測(cè)，降低成本，提高靈敏度和特異度，取得更理想的檢測(cè)效果。

[1]蔡翠霞，肖維威，吳慧慧，等.植物油DNA的高效提取方法研究[J].中國油脂，2014，39（1）：69-72.

[2]李向麗，譚貴良，劉 垚，等.實(shí)時(shí)LAMP法快速檢測(cè)食用植物油中的轉(zhuǎn)基因成分CaMV-35S[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30（2）：244-248.

[3]劉 欣，祝長(zhǎng)青，王毅謙，等.大豆轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中DNA提取方法的比較研究[J].食品科學(xué)，2013，34（4）：199-203.

[4]蔣立斌，張?jiān)粕瑮?華，等.綿羊外周血中游離DNA提取及SRY基因檢測(cè)[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，51（7）：1342-1346.

[5]劉瑞霞，楊玉珍，王國霞，等.油用牡丹‘鳳丹’葉片DNA提取方法研究[J].生物技術(shù)世界，2015（6）：44-45.